引用本文
谢欢, 蒋林峰, 马洪平, 张新全, 刘伟, 彭燕. 狗牙根品种(系)表型及分子遗传变异研究. 草业学报, 2016,25(3): 86-95
XIE Huan, JIANG Lin-Feng, MA Hong-Ping, ZHANG Xin-Quan, LIU Wei, PENG Yan. The phenotypic traits and molecular genetic variation of Bermudagrass ( Cynodon dactylon) cultivars and breeding lines . Acta Prataculturae Sinica,2016,25(3): 86-95  
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狗牙根品种(系)表型及分子遗传变异研究
谢欢1, 蒋林峰2, 马洪平1, 张新全1, 刘伟1, 彭燕1,*
1.四川农业大学动物科技学院草业科学系,四川 成都611130
2.重庆市垫江县畜牧生产站,重庆408300
*通信作者Corresponding author. E-mail:pengyanlee@163.com

作者简介:谢欢(1990-),男,四川宜宾人,硕士.E-mail:5151887579@qq.com

收稿日期: 2015-04-29
基金项目:四川省"十二五"饲草育种攻关项目(2011NZ0098-11)和现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-35-05)资助
摘要

狗牙根系世界著名多年生禾本科暖季型草坪草,广泛用于不同用途草坪建植.本研究对国内审定的5个狗牙根品种,1个新品系及1个国外引进品种进行表型性状和分子遗传的比较研究,以进一步明确我国狗牙根品种资源的利用特性和遗传基础.结果表明,1)供试狗牙根品种(系)'02011'在试验区域的成坪速度为53 d,绿期为269 d,高于国内审定品种;2)反映株高,匍匐茎,旗叶,花序等特性的9个表型性状在品种间差异均达极显著水平( P<0.01);3)各品种(系)在匍匐茎表面颜色,花序抽出度,叶片上表面颜色,生长习性,生殖枝表面花青甙显色,外颖颖壳,颖尖花青甙显色等植物新品种测试性状上表现出不同程度的群体差异;4)SRAP与SSR分子标记各18对引物分别扩增出167和316条谱带,多态性比例分别为87.51%和70.13%,来自相同地域的供试狗牙根品种具有较近的遗传相似度.

关键词: 狗牙根; 表型变异; DUS性状; 遗传多样性
The phenotypic traits and molecular genetic variation of Bermudagrass ( Cynodon dactylon) cultivars and breeding lines
XIE Huan1, JIANG Lin-Feng2, MA Hong-Ping1, ZHANG Xin-Quan1, LIU Wei1, PENG Yan1,*
1.Department of Grassland Science, Animal Science and Technology College, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
2.Department of Livestock Production Station of Dianjiang, Chongqing 408300, China
Abstract

Bermudagrass ( Cynodon dactylon) is a perennial, warm-season turfgrass well known and widely used for different purposes throughout the world. In order to further clarify the characteristics and genetic basis of C. dactylon germplasm in China, this study performed a comparative study of the phenotypic traits and molecular genetics of 5 cultivars and 1 breeding line, as well as 1 cultivar introduced in China. The green stage and turf speed are 53 and 269 d for the breeding line '02011', higher than the 5 cultivars. The differences between cultivars in terms of plant height, flag leaf, creeping stem, and inflorescence characteristics were highly significant ( P<0.01). 8 DUS (distinctness, uniformity and stability) characteristics (including stolon surface color, degrees of heading, color of surface blade, reproductive shoot cyanine glucoside color, growth habit, glume cyanine glucoside color, glume tip cyanine glucoside color) differed among the tested cultivars to varying degrees. 167 and 316 bands were amplified for 18 pairs of primers by SRAP and SSR, of which 87.51% and 70.13% were polymorphic. SRAP and SSR showed that C. dactylon cultivars from the same geographical area could exhibit similar phenotypic traits and relatively close genetic similarities.

Keyword: Cynodon dactylon; phenotypic variation; distinctness; uniformity and stability (DUS) characters; genetic diversity

狗牙根(Cynodon dactylon)隶属于禾本科画眉草亚科(Eragrostoideae)虎尾草族(Chlorideae), 是世界范围内分布最为广泛的多年生暖季型草坪草之一, 原产于非洲, 现在热带, 亚热带和温带沿海地区均有分布.在我国主要分布于新疆, 吉林, 青海, 甘肃, 河北, 黄河流域及以南地区[1].狗牙根因植株低矮, 繁殖力强, 抗旱力强, 耐践踏, 质地细腻, 色泽度好等优点, 被广泛用于建植园林绿化, 运动场, 渠堤护坡, 水土保持等草坪[2].表型性状变异研究广泛应用于种质资源评价, 遗传选育, 育成品种的注册登记及品种鉴定.Simone等[3]对野生型, 改良型和混合型的44份狗牙根表型观测表明, 其生长速度与表型有显著关系, 且匍匐茎生长速率是评价狗牙根品种的重要指标.刘建秀等[4]通过对我国444份狗牙根种源15个外部性状变异规律统计发现, 不同地区狗牙根可根据外部形态聚为5类, 即粗高型, 直立型, 斜高型, 斜矮型和矮生型.郑玉红等[5]对我国50份狗牙根种源根状茎深度, 密度和直径进行田间观测分析, 证明不同狗牙根根状茎特征与其抗寒性有密切联系.

新品种的特异性(distinctness), 一致性(uniformity)和稳定性(stability)简称DUS测试, 是新品种保护的技术基础, 在作物[6, 7]与观赏植物[8, 9]的品种鉴定与保护中提供可靠的判定依据, 而利用DUS技术鉴定狗牙根品种鲜有报道.

传统的表型性状鉴定技术易受栽培技术, 生育期和环境因素影响, 极大制约着品种鉴定结果的准确性.SRAP(sequence-related amplified polymorphism)及SSR(simple sequence repeat)分子标记技术常用于作物[10, 11]或牧草和草坪草品种[12, 13]鉴定.目前该类分子标记技术对狗牙根品种鉴定评价[14, 15, 16]多单一使用, 这会因引物或分子标记技术的差异得到不同的结果, 即对品种鉴定的可信性造成影响.目前结合SRAP与SSR分子标记技术仅用于对狗牙根种质资源的评价[17], 而结合SRAP与SSR鉴定不同狗牙根品种却较少报道.

与国外相比, 我国传统狗牙根育种工作相对滞后, 育成品种少, 截至目前, 审定登记的国审品种仅有12个, 且多数为野生栽培驯化品种.目前国内应用较多的依然是从国外引进的杂交改良品种.本研究结合DUS表型性状与SRAP及SSR分子标记技术对7个狗牙根品种形态及遗传变异进行分析, 探究我国现有狗牙根品种的表型变异与遗传变异基础, 以期为我国狗牙根育种工作的深入开展及促进国内狗牙根品种资源的合理利用提供理论依据和技术支撑.

1 材料与方法
1.1 试验地概况

本研究于四川省雅安市四川农业大学草业科学系科研基地进行, 地理坐标为N 30° 08', E 103° 14', 海拔600 m, 属亚热带湿润季风气候.年均气温为16.2℃ , 最热月(7月)均温25.3℃ , 最冷月(1月)均温6.1℃ , 极端高温37.7℃ , 极端低温-3℃ , 年降水量1774.3 mm, 年蒸发量1011.2 mm, 年均相对湿度79%, 年日照时数1039.6 h, 无霜期304 d, 日均温≥ 5℃ 的年积温5770.2℃ , ≥ 10℃ 年积温5231℃ .试验地土壤系白垩纪灌口组紫色砂页岩风化的堆积物形成的紫色土, 土质黏重, 土壤偏酸pH值为5.6, 有机质含量1.46%, 土壤速效N, P, K含量分别为100.63 mg/kg, 4.73 mg/kg, 338.24 mg/kg, 该区域气候温和, 雨量充沛, 适合于多种草坪草生长, 在四川盆地丘陵平原中具有代表性.

1.2 试验材料

供试的7个狗牙根品种(系)信息见表1.

表1 供试狗牙根品种(系) Table 1 C. dactylon cultivars used in this study
1.3 材料栽植与管理

草皮块移栽于2013年5月13日, 栽植前进行人工除杂, 清除石块, 铁屑等杂物.耕后耙平, 土块细碎, 土块直径≤ 1.5 cm; 地面平整, 墒情好, 移栽前施基肥.每个材料即为一个处理, 7个处理, 每处理重复4次, 共计28个试验小区, 小区面积2 m× 2 m, 采用单因素随机区组方式排列.栽植时, 选取生长健壮的狗牙根匍匐茎段, 每茎段含3个节, 将茎段2个节埋入地下, 1个露出地面, 按株行距5 cm× 15 cm均匀栽植.各试验小区实行统一管理.试验时间为2013-2014年.

1.4 试验内容与方法

1.4.1 表型性状与DUS性状观测 1)成坪速度观测:各试验材料小区盖度达到90%时所需要的天数.

2)物候期及绿期观测:主要物候期(返青期, 盛花期, 枯黄期)的观测以50%的植株进入该时期为准.绿期为返青期至枯黄期之间的天数.

3)表型性状测定:在盛花期, 以小区为单位随机选择10个单株, 利用游标卡尺和直尺等工具, 分别测定株高(直立茎的最高点的自然高度), 匍匐茎长, 匍匐茎节间长(匍匐茎中最长的一级匍匐茎), 匍匐茎节间直径(第4个充分伸展的节间), 旗叶长度, 旗叶宽度, 生殖枝长度, 花序长度, 花序宽度共9个主要表型性状.

4)DUS性状测定:在盛花期观测匍匐茎表面颜色, 花序抽出度, 生长习性, 叶片上表面颜色, 直立茎姿态, 生殖枝表面花青甙显色, 外颖颖壳, 颖尖花青甙显色, 狗牙根DUS性状分级评分标准如表2所示[18].

表2 DUS性状表达分级标准 Table 2 The express classification of distinctness, uniformity and stability character

1.4.2 SRAP与SSR分子标记 1)DNA提取:于每个试验小区中随机选取具有健康叶片的10个单株, 将这40个单株的叶片进行混合待用.利用Doyle等[19]的CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵)法提取DNA, 并分别用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度, 合格的样品保存于-20℃ .

2)SRAP与SSR标记引物及反应体系:参考Li和Quiros[20]SRAP合成正反向引物各8条(表3), 共64对引物组合用于引物筛选, 共获得18对条带清晰, 多态性丰富的引物用于SRAP试验; SSR引物设计参考凌瑶等[17]筛选出的18对狗牙根SSR引物(表4), 引物由上海生工生物技术有限公司合成.PCR反应体系和程序及产物检测参照凌瑶等[17]的方法.

表3 SRAP引物序列 Table 3 Sequences of SRAP primers
表4 SSR引物序列 Table 4 Sequences of SSR primers
1.5 数据分析

利用Excel 2007和SPSS 19.0软件对观测性状的变异程度, 变异规律进行统计分析.对获得的清晰可重复的DNA条带进行统计, 在相同迁移位置上将稳定出现的条带的有或无赋值为1和0进行统计, 构成原始数据矩阵.利用 NTSYS 2.1 统计分析软件计算任意两个供试材料间的遗传相似系数(GS)[21].基于GS矩阵, 按UPGMA法(算术平均非加权配组法)进行遗传相似性聚类, 并绘制树状聚类图.

2 结果与分析
2.1 狗牙根品种(系)成坪速度

供试不同狗牙根品种(系)在试验地具有较强的扩展性, 成坪速度较快.其中'02011'品系成坪速度最快, 仅需53 d, 与成坪速度最慢的'保定'狗牙根相差13 d.各品种(系)成坪速度排序为:保定< 邯郸< 南京< Tifway< 阳江< 川南< 02011(表5).

表5 供试狗牙根品种(系)成坪所需天数 Table 5 The days of turf needed for C. dactylon cultivars (lines)
2.2 主要物候期及绿期

供试狗牙根品种(系)主要物候期如表6所示, 在试验区域, 狗牙根返青期为3月下旬至4月初, 其中, 'Tifway', '02011'与'川南'的返青期为3月下旬, 较其他品种返青早; 盛花期为5月中下旬至6月上旬, 其中'Tifway'开花最早, '南京'开花最晚; 12月中旬以后狗牙根陆续进入枯黄期, '南京'狗牙根最先进入枯黄期, '保定'和'邯郸'较其他品种枯黄期晚.各品种(系)绿期为261~272 d, 其中, 'Tifway'的绿期最长, 为272 d, '南京'的绿期最短, 为261 d.

表6 供试狗牙根主要物候期记录 Table 6 The record of main phenophase for C. dactylon cultivars
2.3 表型性状变异分析

利用SPSS 19.0对供试狗牙根品种9个主要坪用性状单因素方差分析, 在方差齐性检验显示各样本间总体方差齐时, F检验表明, 测定的9个坪用性状均达到极显著(P< 0.01).比较F值发现, 株高是F值 (21.622) 最大的坪用性状, 而生殖枝长的F值(4.325)最小; 根据F值所代表的差异度大小对不同性状变异由小到大的排序为:生殖枝长< 匍匐茎节间直径< 匍匐茎节间长< 旗叶长< 花序宽< 匍匐茎长< 旗叶宽< 花序长< 株高(表7).

表7 供试狗牙根表型性状分析结果 Table 7 The results of studies phenotypic characters of used C. dactylon cultivars cm
2.4 DUS性状变异分析

对供试狗牙根品种DUS测试结果表明, 7个狗牙根品种在8个DUS性状上表现出群体差异(表8).其中, 外颖颖壳与颖尖花青甙显色, 匍匐茎表面颜色差异较小, 品系'02011'匍匐茎表面紫褐色, 颖壳有较深的花青甙显色, 颖尖翠绿, 而品种'保定'颖尖有明显的花青甙显色.其余DUS性状在不同品种间差异较大.品种(系)'02011', 'Tifway'花序抽出度较好, '川南'和'阳江'正好, 而'保定', '邯郸'与'南京'部分抽出; 品种'02011', 'Tifway'和'川南'叶片颜色鲜绿, '保定'和'邯郸'叶片颜色较深; '保定'与'阳江'生殖枝有较深的花青甙显色; 品种'Tifway'匍匐生长, 而'02011', '川南'属于半匍匐生长类型, 且这3个品种狗牙根直立茎斜出.综上所述, 品系'02011'匍匐生长, 直立茎斜出, 叶片鲜绿, 花序抽出度较好, 外颖颖壳具有较深的花青甙显色, 与其他已登记申报的品种具有明显的差异.

表8 狗牙根品种(系)DUS性状 Table 8 The distinctness, uniformity and stability character of C. dactylon cultivars (lines)
2.5 狗牙根品种(系)表型性状聚类分析

利用SPSS 19.0对供试狗牙根品种主要坪用性状与DUS性状聚类分析表明(图1), 在欧式距离为12.0时, 可将7个品种(系)主要分为4个类组, 第I聚类组为品种'保定', '邯郸', 这类狗牙根植株较为高大, 茎粗, 叶片较大且颜色较深, 品种原产地分别为河北的保定和邯郸地区; 第II类组仅有品种'南京', 其植株较高, 叶片较大, 原产地为江苏南京; 第III聚类包括'Tifway', '川南'和'02011', 此类品种狗牙根植株低矮, 节间细小, 叶片细小而致密且颜色鲜绿; 第IV类组有品种'阳江', 品种原产地为广东, 植株较为低矮, 叶片较小.

图1 7个品种(系)狗牙根表型性状聚类结果Fig.1 Dendrogram of 7 C. dactylon cultivars (lines) derived by UPGMA from the phenotype data

2.6 狗牙根品种(系)SRAP和SSR标记分析

2.6.1 狗牙根SRAP与SSR标记多态性分析 采用SRAP与SSR引物对7个狗牙根品种(系)DNA进行PCR扩增, 由表9可知, SRAP与SSR扩增总条带分别为167与316条DNA带, 多态性条带分别为146和226条, 平均每对引物扩增出的多态性条带分别为8.11和12.55条, 引物的平均多态性比率(PPB)分别为87.51%和70.13%.SRAP引物等位位点多态性信息含量(PIC)变幅为0.2755~0.4388, 平均值为0.3714.SSR引物PIC变幅为0.2993~0.4828, 平均为0.3818.数据结果表明SRAP与SSR分子标记在狗牙根中具有良好的多态性, 可以用于狗牙根种质间遗传多样性分析(图2).

表9 狗牙根 SRAP 和 SSR 标记的多态性 Table 9 Amplification results from 18 primer combinations based on SRAP and SSR markers

图2 7个品种(系)狗牙根SRAP(左)和SSR(右)扩增结果Fig.2 Amplified of 7 C. dactylon cultivars (lines) by SRAP (left) and SSR (right)

2.6.2 狗牙根SRAP和SSR标记聚类分析 合并SRAP与SSR标记, 利用UPGMA法构建7个不同狗牙根品种(系)聚类图(图3).在遗传相似系数(GS)为0.75时可将供试材料分为5个聚类组, 第I聚类组共有2个品种, 分别为'邯郸', '保定'; 第II聚类组共有2个品种(系), 分别为'02011'和'川南'; 品种'Tifway', '阳江'和'南京'单独聚类.聚类结果显示, 不同地区的材料遗传变异较大, 地理来源相同的材料聚为一类, 表明供试材料与其地理来源及地理分布存在明显的相关性.

图3 7个品种(系)狗牙根遗传多样性聚类图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 7 C. dactylon cultivars (lines) based on SRAP and SSR markers

3 讨论
3.1 供试狗牙根表型性状变异特点

草坪草有观赏, 绿化等多种用途, 因而被广泛用于庭园, 公园, 运动场等公共场所.优质草坪草是城市建设和园林绿化中的重要组成部分, 其不仅可以提高城市美感, 而且能够作为环境净化的调节剂[22].本试验中供试狗牙根成坪速度快, 绿期长, 但不同品种间具有差异.从西南地区选育的品种(系)'02011'和'川南'成坪速度分别需53与56 d, 而绿期为269 d, 优于品种'南京', '保定'与'邯郸'.这与初秀娟等[23]试验结论相似, 品种(系)'02011'和'川南'对西南地区的适应性较优于品种'Tifway'与'南京'.另外, 不同狗牙根品种表型性状具有广泛的变异, 7个供试狗牙根品种(系)在生长习性, 直立茎姿态, 叶片颜色与匍匐茎表面颜色等DUS性状测试下可以将其进行区别.试验中不同狗牙根品种表型性状变异具有一定的规律, 综合表型性状与DUS性状的聚类结果可将供试狗牙根品种分为4类:品种'保定', '邯郸'为一类, 此类狗牙根植株高, 叶片大且颜色深; 品种(系)'川南'和'02011'植株低矮, 节间细小, 叶片细小而致密且颜色鲜绿, 且与杂交品种'Tifway'归于同类, 表明四川的2个狗牙根品种(系)坪用特性较为优良, 与其他品种相比, 在外观形态上杂交狗牙根相似度更高一些; 而品种'南京'植株较高, 叶片较大, 品种'阳江'植株较为低矮, 叶片较小, 所以这两个狗牙根品种分别聚为一类.刘建秀等[4]将我国狗牙根根据表型形态分为5类, 与本试验中不同地区品种(系)狗牙根分类类似.综上所述, 测试的品系'02011'植株低矮, 匍匐茎细长且多节, 短时间内能迅速成坪, 加之叶片细而致密, 颜色鲜绿, 绿期长, 能够形成较为均一的草坪, 具有较好坪用价值, 可作为我国西南地区优质草坪草资源.

3.2 供试狗牙根分子遗传特点

利用分子标记技术能充分了解植物种质资源遗传背景, 对于新品种合理选择与改良具有重要意义.本试验利用SRAP和SSR分子标记分别获得了87.51%与70.13%多态性, 高于刘伟等[24]与易杨杰等[25]对狗牙根遗传多样性研究结果, 说明这两种分子标记多态性丰富, 适用于狗牙根品种鉴定.另外, 试验结合SRAP与SSR分子标记结果对7个不同品种(系)狗牙根聚类分析发现, 不同地理来源的狗牙根可聚为一类, 如华北地区狗牙根品种'保定'和'邯郸', 西南地区狗牙根品种(系)'川南'与'02011', 长江中下游地区狗牙根品种'南京'及其以南地区品种'阳江', 国外引进品种'Tifway', 这与凌瑶等[17]合并多种分子标记结果研究狗牙根遗传多样性结果类似.而刘君等[15, 16]试验结果将品种'南京', '阳江'和'Tifway'区分于3个不同的聚类组也与本试验结果相同.由此可见, 结合多种分子标记结果比采用单一分子标记更能较综合, 全面地反映狗牙根遗传变异特点, 并有效用于狗牙根品种的分子鉴定.

3.3 供试狗牙根表型变异与分子遗传的相互关系

表型性状和分子标记是两种常用的遗传相似性分析方法.分子标记体现DNA水平的差异, 而表型性状是环境和DNA变异共同调控的结果.本研究分别利用表型基础与遗传基础对供试狗牙根品种(系)聚类分析.聚类结果反映了供试狗牙根品种(系)与其来源的地域环境具有一定的相关性, 来自相同地域的狗牙根具有相似的表型性状与较为接近的遗传基础; 但基于表型性状和分子标记聚类结果并不完全相同, 品种'保定'与'邯郸', '川南'与'02011', '南京'在形态水平和分子水平上能进行聚类, 而品种'Tifway'在形态上趋于西南地区狗牙根, 分子水平却单独聚类.其中可能原因, 首先表型性状范围大, 覆盖面广, 植物的形态, 生理, 生长发育都能影响其变异来源, 大多数数量性状也易受环境变化影响, 国外引进的狗牙根品种种植于西南地区, 可能产生一定形态变异; 其次, 基因组的变化不只是部分SRAP与SSR引物能够完整揭示, 不同引物和分子标记手段得到的结果也不一定相同, 同时'Tifway'属于美国引进的杂交狗牙根, 遗传基础本身与国内狗牙根品种存在差异.所以, 利用多种分析方法研究狗牙根表型与遗传多样性, 能够更好地揭示狗牙根潜在的利用价值, 为收集和改良狗牙根种质资源, 选育新型狗牙根品种奠定基础.

4 结论

本研究通过对我国7个主要狗牙根品种(系)的坪用物候期, 成坪速度, 绿期, 表型性状, DUS性状及分子遗传多样性系统研究表明, 各供试狗牙根品种表型性状与遗传背景差异明显.品系'02011'在成坪速度, 绿期, 坪用性状等方面表现突出, 且分子水平与其他品种存在差异, 是具有潜力的狗牙根新品系.

The authors have declared that no competing interests exist.

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