试验于2013年3-8月在典型的川中丘陵区简阳市进行, 地理位置为东经104° 53', 北纬30° 38', 海拔490 m左右。该地区属亚热带季风气候, 年平均温度17.0 ℃, 年平均降雨量874 mm, 年无霜期311 d。供试材料为前期筛选的耐低氮品种‘ 正红311’ (ZH311)和低氮敏感品种‘ 先玉508’ (XY508)^[20], 两品种在西南地区种植生育期基本一致, 均在120 d 左右。

采用大田种植, 试验地0~20 cm耕层土壤有机质16.60 g/kg, 全氮1.24 g/kg, 全磷(P)0.73 g/kg, 全钾(K)12.54 g/kg, 碱解氮25.22 mg/kg, 有效磷(P)13.54 mg/kg, 速效钾(K)138.75 mg/kg和pH值 8.63。

采用裂区试验设计, 主区为不同耐低氮性玉米品种: ‘ 正红311’ 和‘ 先玉508’ ; 副区为氮肥用量:N₀ (0 kg/hm²)、N₁ (90 kg/hm²)、N₂ (180 kg/hm²)、N₃ (270 kg/hm²)、N₄ (360 kg/hm²)和N₅ (450 kg/hm²) 6个氮肥处理, 共12个处理。其中N₀和N₁低氮处理, N₄和N₅为充分供氮处理。主区与副区均随机排列, 小区面积为20 m² (4 m× 5 m), 3次重复, 共36个小区。所用氮肥为尿素, 其中50%的氮肥做底肥, 50%大口期追肥, 采用窄厢中沟施肥。另施过磷酸钙600 kg/hm²、氯化钾150 kg/hm²作底肥。采用宽窄行种植, 行距为1.5 m+0.5 m, 株距为20 cm。玉米采用覆膜直播, 单株栽培, 种植密度为50000株/hm²。玉米生长期给予良好的田间管理并保证水分供应充足, 小区间保持一致。

1.3.1 SPAD值的测定

于玉米播种后40、60、80、100、120 d用SPAD-502型便携式叶绿素仪^[21]测定叶绿素含量, 即SPAD值(抽雄前测定最上一片定型叶, 抽雄后测定穗位叶), 每小区20片。于吐丝后30 d用SPAD-502型便携式叶绿素仪测定植株不同部位叶片SPAD值(穗位叶上两叶开始往下测直至最下一片绿叶), 每小区测定10株。

1.3.2 氮代谢关键酶活性的测定

于吐丝后10、20、30 d取玉米穗位叶, 每小区4片去叶脉剪碎混匀, 用液氮速冻后带回实验室, 于-80 ℃超低温冰箱中保存, 用于硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性的测定。NR活性采用磺胺比色法^[22]测定; GS活性和GDH活性采用文献[23]的方法测定。

1.3.3 叶片含氮量、籽粒蛋白质含量和产量的测定

于吐丝后10 d每小区取4株穗位叶, 于105 ℃下杀青30 min, 然后80 ℃烘干至恒重, 用高速粉碎机粉碎, 过0.3 mm筛后用塑封袋保存用于测定全氮含量。测定时称样0.20 g, 按凯氏定氮法^[24]消煮, 用FOSS8400凯氏定氮仪测定。

将成熟期籽粒烘干后用高速粉碎机粉碎, 过0.3 mm筛后用塑封袋保存用于测定全氮含量。全氮测定方法同上, 籽粒蛋白质含量以测定后的全氮含量除以系数0.16换算。

于成熟期统计每小区有效株数和有效穗, 然后取连续20株带回实验室考种, 最后将每小区剩余植株全部收获, 并按水分含量14%折算每小区实际产量。

采用Excel 2007对所得数据进行初步处理, SPSS 20.0统计分析软件进行方差分析和相关分析, 并用GraphPad Prism 5 作图。采用LSD法进行差异显著性检验, 显著水平设为0.05, 数据均为平均值± 标准误(means± SE); 相关分析中, * 和* * 分别表示在5%和1%水平上差异显著。

各施氮量对不同耐低氮性玉米品种各生育时期叶绿素含量的影响如图1所示。氮肥显著提高了玉米各时期叶片的SPAD值。随着生育进程的推进两品种SPAD值均表现出先增加后降低的趋势, 在播种后80 d达到最高。各施氮处理平均, 正红311在播种后40、60、80、100和120 d时较N₀分别提高5.18%、7.47%、22.33%、18.17%和12.60%, 而同期先玉508的增幅分别为15.31%、9.40%、25.99%、19.52%和15.27%, 表明氮肥对低氮敏感品种先玉508各时期SPAD值促进作用更大。在播种后40 d正红311 SPAD值随施氮量增加而增加, 播种后60、80、100和120 d SPAD值则随施氮量的增加先增后减; 先玉508在播种后40、60和80 d SPAD值均随施氮量增加而增加, 到生育后期(100和120 d)才表现出随施氮量的增加先增后减。

耐低氮品种正红311生育前期利用充足的氮肥提高叶绿素含量, 使叶绿素含量在生育期就保持在较高水平, 有效地增强了叶片的光合能力并延长了光合时间。低氮敏感品种先玉508要通过较长的生育时期才能充分发挥氮肥潜力, 且到达生育高峰后较正红311出现早衰, 生育后期SPAD值下降幅度显著高于正红311。

各施氮量对不同耐低氮性玉米品种各部位叶片叶绿素含量的影响如图2所示。从不同叶位来看, 施氮肥可以显著提高玉米吐丝后30 d各部位叶片SPAD值, 其中对下部叶片的促进作用较上部叶片更大。随叶位上升, 两品种吐丝后30 d SPAD值均表现出先升高后降低的趋势, 均以穗位叶(0位叶)最高。氮肥显著促进了各部位叶片叶绿素含量的提高, 但对各部位叶片的促进作用差异明显, 随叶位升高促进作用呈单峰变化, 两品种均表现为穗位上一叶(1位叶)促进作用最小, 正红311和先玉508仅分别提高6.66%和3.34%。耐低氮品种正红311吐丝后30 d各部位叶片SPAD值均高于低氮敏感品种先玉508, 且随叶位向下两品种差异加大。ZH311 的-5~2叶位在6个氮肥水平下SPAD值变异系数分别为45.27%、22.90%、11.53%、5.92%、5.50%、6.01%、4.07%和4.67%; XY508在吐丝后30 d, 穗下第4叶部分处理下已枯死, 第5叶已完全枯死, 其-3~2叶位变异系数分别为38.25%、12.47%、9.39%、6.93%、6.75%和4.44%。可以看出, 氮肥对玉米叶片的影响随着叶位的上升而减小, 正红311的影响程度较先玉508小。相较于低氮敏感品种先玉508, 耐低氮品种正红311在生育后期能够延缓叶片的衰老, 更好的保持叶片叶绿素含量从而保证了生育后期的物质生产, 且这种优势在中下部叶片上表现得更为明显。

图1

Fig.1

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	图1 氮肥对玉米各生育时期SPAD值的影响Fig.1 Effects of nitrogen fertilizer on SPAD value of maize in different stages

图2

Fig.2

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	图2 吐丝后30 d各部位叶片SPAD值差异 0位叶:穗位叶; -1~-5位叶:穗位下1~5叶; 1~2叶:穗位上1~2叶。Fig.2 Differences of leaf SPAD value of maize after silking 30 d 0 node: Ear leaf; -1--5 node: Below ear leaf 1-5 nodes; 1-2 node: Above ear leaf 1-2 nodes.

硝酸还原酶(NR)活性的高低能够反应植物体内氮代谢相关强度并与玉米的产量呈正相关^[11]。增施氮肥可显著提高玉米穗位叶的NR活性, 施氮量与NR活性呈正比(图3)。与N₀相比, 正红311 N₁~N₅处理NR活性分别提高了11.73%、19.06%、29.79%、52.24%和111.12%, 先玉508分别提高了43.37%、82.54%、106.60%、118.93%和174.81%, 低氮敏感品种穗位叶NR的活性上升的幅度大于耐低氮品种。正红311 N₀~N₅处理NR活性较先玉508分别提高439.43%、320.38%、252.00%、238.89%、275.10%和314.40%。表明耐低氮品种对氮素缺乏较不敏感, 在不同的氮素水平下均能保持较高的NR活性, 对氮素同化、吸收能力较低氮敏感品种强, 在中低氮水平下其优势更突出。

各施氮量对不同耐低氮性玉米品种叶片谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响如图4所示。不同施氮处理下两玉米品种穗位叶的GS活性随生育进程的推进呈先增加后降低的趋势, 以吐丝后10 d的GS活性最高。增施氮肥可以显著提高玉米生育后期穗位叶的GS活性, 在一定范围内其活性随施氮量的增加而增加, 但超过一定施氮量, GS活性提高的幅度减缓甚至降低。正红311的GS活性在不同时期和氮肥水平下均较先玉508的高, 各施氮处理平均, 正红311在吐丝、吐丝后10、20、30 d穗位叶的GS活性分别较先玉508高14.15%、15.00%、21.90%和30.23%, 随着灌浆进程推进提高幅度增大; 各取样点平均, 正红311在N₀~N₅处理下GS活性较先玉508分别高34.14%、28.21%、16.43%、18.67%、14.10%和12.29%, 在低中氮水平下提高的幅度更大。

图3

Fig.3

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	图3 吐丝后10 d施氮量对硝酸还原酶(NR)活性的影响 不同小写字母表示差异达5%显著水平。Fig.3 Effect of nitrogen levels after silking 10th day on leaf nitrate reductase (NR) activity Different small letters are significantly different at 5% level.

图4

Fig.4

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	图4 施氮量对谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响Fig.4 Effect of nitrogen levels at different stages on leaf glutamine synthetase (GS) activity

不同施氮处理下随着生育进程的推进两玉米品种的谷氨酸脱氢酶(GDH)活性呈不同的变化趋势(图5)。除N₀、N₅处理, 正红311的GDH活性先增加后降低, 而后又增加, 峰值在吐丝后10和 30 d; 正红311 N₀、N₅处理和先玉508的各施氮处理GDH活性呈先增加后降低的趋势, 正红311以吐丝后10 d活性最高, 先玉508峰值在吐丝后10或20 d。在同一取样时间, 正红311穗位叶的GDH活性均高于先玉508。各施氮处理平均, 正红311在吐丝、吐丝后10、20、30 d GDH活性较先玉508分别高36.56%、27.48%、11.85%和55.57%。两品种叶片GDH 活性在吐丝后20 d差异最小, 而在吐丝后30 d差异最大, 表明耐低氮品种能够在花后特别是生育后期维持较高的GDH活性。施氮可以显著提高玉米生育后期叶片的GDH活性, 但两品种不同处理的同一取样时间增幅差异明显。两品种均在吐丝后10 d增幅最小, 而增幅最大正红311出现在吐丝后30 d, 先玉508则在吐丝期。各取样时间正红311较先玉508均具有更高的GDH活性, 各取样时间平均, 正红311 N₀~N₅处理较先玉508分别高27.34%、36.09%、33.00%、33.93%、34.73%和21.24%。在低中氮水平下两品种叶片GDH活性差异更大, 表明耐低氮品种在低中氮条件下能保持更强的氮素同化能力。

图5

Fig.5

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	图5 施氮量对谷氨酸脱氢酶(GDH)活性的影响Fig.5 Effect of nitrogen levels at different stages on leaf glutamate dehydrogenase (GDH) activity

施肥能够显著提高玉米的叶片含氮量和产量(表1)。吐丝后10 d穗位叶的含氮量(Y)随着施氮量(X)的增加而增加, 二者呈线性正相关, 回归方程分别为Y_ZH311=2.43+0.001527X(R²=0.8107^* )和Y_XY508=2.38+0.001762X(R²=0.8422^{* *} ), 随氮肥水平的提高, 先玉508穗位叶含氮量提高的幅度大于正红311, 即正红311穗位叶含氮量受氮肥水平的影响较小, 在中低氮水平下也能保持较高的含氮量。两供试品种的籽粒产量均随氮肥水平的增加呈先增加后降低的趋势, 以中高施氮量最高。正红311产量的高低顺序为N₃> N₄> N₂> N₅> N₁> N₀, 先玉508的顺序为N₄> N₂> N₅> N₁> N₃> N₀, 由此表明, 就高产而言, 正红311适宜的氮肥水平较先玉508更低。与先玉508相比, 正红311在各施氮处理下的产量均更高。N₀~N₅处理下, 正红311产量比先玉508分别高9.92%、8.89%、9.27%、12.82%、9.23%和8.08%, 正红311在低中氮水平下的产量优势显著高于高氮处理。

耐低氮品种正红311各氮水平籽粒蛋白质含量均显著高于低氮敏感品种先玉508, 各氮处理平均高出3.75%; 施氮两品种籽粒蛋白质含量均显著提高, 与N₀相比, 各施氮处理平均, 正红311提高了6.90%, 而先玉508提高了7.52%, 施氮对先玉508籽粒蛋白质含量的促进作用更大; 两品种籽粒蛋白质含量均随氮肥水平提高而呈增长趋势, 但增幅逐渐缩小, 尤其是正红311, 在N₂以后几乎不再增长, 而先玉508在N₅以后都还有一定增长, 以N₅水平最高。表明耐低氮品种较低氮敏感品种更加耐瘠, 对低氮环境的适应性更强, 在低中氮水平下便能保持较高的籽粒蛋白质含量, 而低氮敏感品种在低中氮处理下籽粒蛋白质含量较低, 增施氮肥更有利于其籽粒蛋白质含量的提高。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 施氮量对产量、叶片含氮量及籽粒蛋白质含量的影响 Table 1 Effects of nitrogen levels at different stages on yield, nitrogen content of leaves and protein content of seeds 品种 Cultivars 氮肥处理 Treatment of nitrogen fertilizer 叶片含氮量 Nitrogen content of leaf (%) 产量 Yield (t/hm2) 蛋白质含量 Protein content (%) 正红311 ZH311 N0 2.25± 0.02e 6.48± 0.16b 6.65± 0.04b N1 2.68± 0.01d 7.24± 0.08a 6.71± 0.04b N2 2.86± 0.04c 7.34± 0.10a 7.17± 0.04a N3 2.86± 0.06c 7.43± 0.15a 7.21± 0.04a N4 2.90± 0.02b 7.37± 0.16a 7.19± 0.06a N5 3.08± 0.06a 7.24± 0.05a 7.25± 0.19a 先玉508 XY508 N0 2.20± 0.02e 5.89± 0.14b 6.38± 0.06e N1 2.62± 0.01d 6.64± 0.14a 6.67± 0.07d N2 2.88± 0.07c 6.71± 0.09a 6.81± 0.00c N3 2.89± 0.04c 6.58± 0.14a 6.85± 0.04bc N4 3.00± 0.04b 6.74± 0.09a 6.94± 0.06ab N5 3.08± 0.03a 6.70± 0.17a 7.00± 0.06a Values followed by different small letters in the same column are significantly different at 5% level. 同一列不同小写字母表示差异达5%显著水平。

表1 施氮量对产量、叶片含氮量及籽粒蛋白质含量的影响 Table 1 Effects of nitrogen levels at different stages on yield, nitrogen content of leaves and protein content of seeds

由表2可见, 玉米产量和籽粒蛋白质含量与吐丝后10 d的SPAD值、叶片含氮量和氮代谢关键酶活性均呈正相关, 不同品种各指标间相关性的显著水平存在差异。正红311的产量与叶片含氮量、SPAD值和GDH活性呈显著正相关, 与GS活性呈极显著正相关; 籽粒蛋白质含量与叶片含氮量、GS活性呈显著正相关, 与SPAD值呈极显著正相关。先玉508的产量与叶片含氮量、GS活性呈显著正相关, 与SPAD值呈极显著正相关; 籽粒蛋白质含量与叶片含氮量、SPAD值和氮代谢酶活性均呈极显著正相关。增施氮肥可以促进玉米叶片含氮量、叶绿素含量及氮代谢关键酶活性的增加, 进而提高了玉米光合作用和氮代谢的能力, 提高了籽粒蛋白质含量及产量。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 产量和蛋白质含量与吐丝后10 d SPAD值、叶片含氮量、氮代谢酶活性的相关性 Table 2 Correlation coefficients of yield and protein content with SPAD value, nitrogen content of leaves and enzyme activity in nitrogen metabolism after silking 10 days 指标Indexes 正红311 ZH311 先玉508 XY508 产量 Yield 蛋白质含量Protein content 产量 Yield 蛋白质含量Protein content 产量 Yield 1 0.745 1 0.889* 蛋白质含量Protein content 0.745 1 0.889* 1 叶片含氮量 Nitrogen content of leaves 0.872* 0.885* 0.903* 0.997* * 叶绿素相对含量 SPAD value 0.900* 0.938* * 0.941* * 0.987* * 硝酸还原酶活性 NR activity 0.383 0.678 0.733 0.954* * 谷氨酰胺合成酶活性 GS activity 0.947* * 0.831* 0.907* 0.980* * 谷氨酸脱氢酶活性 GDH activity 0.905* 0.660 0.737 0.961* * * 和* * 表示在5%和1%水平上差异显著。* and * * indicate significant correlations at the P< 0.05 and P< 0.01 probability levels according to LSD test, respectively.

表2 产量和蛋白质含量与吐丝后10 d SPAD值、叶片含氮量、氮代谢酶活性的相关性 Table 2 Correlation coefficients of yield and protein content with SPAD value, nitrogen content of leaves and enzyme activity in nitrogen metabolism after silking 10 days

叶片含氮量与叶绿素含量密切相关, 科学施用氮肥可以提高叶片叶绿素含量进而影响植株光合作用^{[25, 26]}。李猛等^[8]研究表明, 比较低氮条件与正常施氮条件下同一基因型的玉米叶绿素含量差异, 是反映该基因型是否对氮素反应敏感的重要依据, 通常对氮素同化能力强的玉米品种叶绿素含量相对较高^[1]。本试验结果表明, 增施氮肥可以显著提高玉米各生育时期叶片的叶绿素含量, 但提高的幅度在品种间存在一定差异, 氮肥每增加100 kg/hm², 正红311和先玉508吐丝后10 d穗位叶的含氮量分别提高0.15%和0.18%, 正红311提高的幅度远小于先玉508, 即氮肥对先玉508穗位叶含氮量的促进作用更大, 表明低氮敏感品种对氮素缺乏更敏感。找出不同品种适宜的施氮水平, 可以有效地调节玉米体内叶绿素的含量, 延缓叶片衰老和光合功能衰退^[27]。在低中氮水平(90~270 kg/hm²)下, 耐低氮品种在生育前期叶绿素含量增幅大, 后期降幅小, 从而延缓叶片的衰老进而使植株整个生育时期保持较强的光合能力, 促进有机物质的合成, 这种防止叶片早衰的优势在耐低氮品种中下叶部体现地更为明显, 这可能是其耐低氮能力强的生理机制之一, 此优势在高氮水平下表现不明显。而低氮敏感品种则需充分施氮(270~450 kg/hm²)才能保持较强的光合能力。

氮代谢是影响植物代谢和发育的重要生理过程, 氮代谢关键酶更是影响着植物氨的同化和氨基酸的合成^[28]。硝酸还原酶是植物氮代谢的关键酶和限速酶, 其活性高低与植物体内氮同化能力密切相关^[17]。谷氨酰胺合成酶是处于氮代谢中心的多功能酶, 参与多种氮代谢调节^{[28, 29]}。Teng等^[30]研究表明, 耐低氮品种的低氮耐受性的机制之一是由于其较高的GS活性而提高了氮同化效率。谷氨酸脱氢酶是高等植物体内促进N H4+同化和氨基酸、蛋白质合成的关键酶之一^[31]。叶利庭等^[32]研究表明, 当作物尤其在生育后期遇到环境胁迫时, GDH对催化N H4+合成谷氨酸具有重要作用。

本试验结果表明, 对不同耐低氮性玉米品种施用其适宜的施氮量能够有效提高穗位叶NR、GS及GDH的活性。各氮水平下低氮敏感品种氮代谢关键酶活性的增幅高于耐低氮品种, 但耐低氮品种的活性尤其在低中氮水平下显著高于低氮敏感品种。吐丝后10 d耐低氮品种正红311 NR、GS及GDH活性6个氮肥水平下的变异系数分别为27.85%、4.51%及8.45%, 低氮敏感品种先玉508变异系数分别为30.76%、11.13%及7.93%, 可见氮肥对低氮敏感品种先玉508的影响和促进作用(尤其在中高氮水平下)更大, 表明需对先玉508施足量氮肥来保证其较高的氮代谢关键酶活性, 进而增强对氮素的吸收同化能力。耐低氮品种正红311受施氮量的影响较小, 对环境中的氮素含量有较强的调节适应力, 在低中氮水平(90~270 kg/hm²)下能够维持较低氮敏感品种高的氮代谢酶活性以保证其较强的氮代谢能力。与低氮敏感品种相比, 耐低氮品种的穗位叶能够在整个灌浆结实期尤其是灌浆后期维持较高的GS和GDH活性, 促进了植株的氮同化从而提高植株籽粒产量和蛋白质含量, 这种优势在低中氮水平下表现得更为明显。

综上表明, 耐低氮品种正红311相对耐瘠, 而先玉508则相对耐肥, 因此先玉508种植在土壤肥沃的地区或地块并适当增加施肥量, 而正红311则可布局到土壤相对贫瘠的区域, 适当降低施肥量。