于2015年3月以野生葎草种子为材料, 采用高34 cm、口径50 cm花盆, 以河沙∶ 腐殖土1∶ 1均匀混合为基质, 按10粒/盆播种, 共30盆。在25 ℃下培养, 幼苗1~2对真叶时, 随机按3株/盆定苗(避免人为造成性比例失衡)。10盆为1组, 分别移入15, 20, 25 ℃的人工气候培养箱(ZRX-1000DC), 设光照12 h/黑暗12 h, 光照强度1300 lx, 相对湿度32%下进行培养。待花芽分化现花序识别雌雄时, 按性别每株取由上而下第3叶进行光合测定后, 摘取、剪碎、混合后保鲜备用, 测定生理指标。

1.2.1 光合指标测定

叶绿素含量采用乙醇丙酮混合提取法^[14]。用LI-6400便携式光合仪, 光照强度1300 lx下测现实光合速率, 在有效辐射为850 μ mol/(m²· s)(光响应曲线表明该光照下P_n最大)的内置光源下测潜在光合速率, 于第3叶中部随机3点连续采集3个值。每组随机选雌、雄各3株, 在105 ℃下烘至恒重后, 称单株生物量。

1.2.2 代谢指标测定

用“ 苏州科铭生物有限公司” 生产的试剂盒, 测定可溶性糖(SS)、丙酮酸(PA)含量和硝酸还原酶(NR)活性^[13]。

1.2.3 抗性指标测定^[14]

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑(NBT)光化还原法, 过氧化物酶(POD)活性测定采用愈创木酚法, 过氧化氢酶(CAT)活性测定采用紫外吸收法。

1.2.4 受伤害指标测定^[15]

丙二醛(MDA) 采用硫代巴比妥酸(TBA)法, 脯氨酸(Pro)采用酸性茚三酮法, 可溶性蛋白(SP)含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法, 过氧化氢(H₂O₂)含量采用钼酸法。

用SAS 10.0软件对所有数据进行方差分析和析因分析, 并用Duncan法对各参数进行显著性检验(SNK检验)。

叶绿素含量在性别间无显著差异(P> 0.05), ♀株的P_n和生物量显著大于♂株(P< 0.05)(表1)。3个温度下♀株的同化能力及物质积累能力均强于♂株。温度对叶绿素含量和P_n有显著影响, 20 ℃下叶绿素含量显著低于25 ℃(P< 0.05), 15 ℃时恢复到25 ℃的水平; 随温度下降P_n和单株生物量显著逐步下降(P< 0.05), 15 ℃时P_n值和生物量降为25 ℃时的50%左右。♀株的潜在P_n显著大于♂株(P< 0.05), 15 ℃时潜在P_n显著高于其他温度。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 温度对叶绿素含量和光合速率影响的SNK检验 Table 1 SNK test about chlorophyll content and photosynthesis rate in different temperature 温度 Temperature (℃) 性别 Sex 总叶绿素 Chlorophyll (Chl a+b, mg/g) 光合速率 Photosynthetic rate (Pn, μ mol/m2· s) 潜在光合速率 Potential photosynthetic rate (Potential Pn, μ mol/m2· s) 生物量 Biomass of plant (g/plant) 25 ♀ 1.94± 0.31bAa 6.06± 0.27Aa 7.26± 0.30Ab 2.31± 0.18Aa ♂ 3.04± 0.46bAa 5.07± 0.14Ba 5.65± 0.37Bb 1.52± 0.12Ba 20 ♀ 1.66± 0.38Ab 3.19± 0.44Ab 3.91± 0.34Ac 1.65± 0.14Ab ♂ 1.13± 0.65Ab 3.07± 0.71Bb 3.89± 0.53Bc 1.47± 0.17Bb 15 ♀ 2.29± 0.46Aa 2.96± 0.13Ac 8.69± 0.31Aa 1.03± 0.12Ac ♂ 2.32± 0.38Aa 2.73± 0.53Bc 7.43± 0.37Ba 0.61± 0.18Bc Note: ♀-Female, ♂-Male. Different capital letters in the same column indicate significant difference between genders at 0.05 level, different lower letters within the same column indicate significant difference among temperatures at 0.05 level. The same below. 注:♀-雌株, ♂-雄株。同列不同大写字母表示性别间差异显著(P< 0.05), 不同小写字母表示温度间差异显著(P< 0.05)。下同。

表1 温度对叶绿素含量和光合速率影响的SNK检验 Table 1 SNK test about chlorophyll content and photosynthesis rate in different temperature

方差分析表明, P_n、潜在P_n及单株生物量在性别间和温度间均有极显著差异(P< 0.01)(表2)。由F值可见, 温度对叶绿素和光合速率的影响大于性别。温度与性别互作对叶绿素含量、P_n及生物量无显著影响。性别影响为生物量> 潜在P_n> P_n> 叶绿素含量, 温度影响为P_n> 潜在P_n> 生物量> 叶绿素含量。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 叶绿素含量和光合速率差异的双因子方差分析 Table 2 Two-factor variance analysis about chlorophyll content and photosynthesis rate 变异来源 Source 项目 Item 叶绿素 含量 Chl a+b 光合 速率 Pn 潜在光合速率 Potential Pn 生物量 Biomass 总处理 Corrected model F 1.71 35.51 18.87 18.66 P 0.228 < 0.001 < 0.001 < 0.001 温度 Temperature F 8.55 60.45 48.23 44.91 P 0.035 < 0.001 < 0.001 < 0.001 性别Sex F 0.25 8.74 8.94 14.10 P 0.627 0.004 0.003 0.001 互作间 Interaction F 1.79 2.83 1.97 1.99 P 0.222 0.067 0.167 0.161 Note: F value indicate the significance of the F test, with greater F value means the more significant, and P value indicates the probability value. The same below. 注:F值表示F检验的显著性, F越大表示越显著, P值表示概率值。下同。

表2 叶绿素含量和光合速率差异的双因子方差分析 Table 2 Two-factor variance analysis about chlorophyll content and photosynthesis rate

♂株的SS和PA含量显著高于♀株(P< 0.05)(表3), NR活性在性别间无显著差异(P> 0.05)。温度对SS和PA含量及NR活性有显著影响(P< 0.05), 随温度下降SS含量显著增加(P< 0.05), ♂株比♀株增加更快; NR活性显著逐步降低(P< 0.05), ♂株和♀株下降无差异。PA含量在25和20 ℃间无显著变化, 15 ℃时显著增加。

方差分析说明, 性别对SS和PA含量有显著影响(P< 0.05); 温度对PA含量有显著影响(P< 0.05), 对SS含量和NR活性有极显著影响(P< 0.01)(表4)。温度对代谢指标的影响远大于性别, 温度和性别对代谢指标无显著交互作用。性别对代谢影响为SS> PA> NR, 温度的影响为NR> SS> PA。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 温度对SS、PA和NR影响的SNK检验 Table 3 SNK test about SS, PA and NR in different temperature 温度 Temperature (℃) 性别 Sex 可溶性糖 Soluble sugar (SS, mg/g) 丙酮酸 Pyruvic acid (PA, μ g/g) 硝酸还原酶 Nitrate reductase (NR, U/g) 25 ♀ 7.15± 0.52Bc 3.79± 0.56Bb 0.49± 0.04Aa ♂ 9.98± 0.92Ac 4.25± 0.45Ab 0.51± 0.03Aa 20 ♀ 15.52± 2.18Bb 3.27± 0.22Bb 0.35± 0.01Ab ♂ 18.18± 2.63Ab 4.27± 0.75Ab 0.42± 0.05Ab 15 ♀ 18.22± 2.04Ba 4.77± 0.45Ba 0.28± 0.00Ac ♂ 31.98± 2.67Aa 5.56± 0.17Aa 0.27± 0.02Ac

表3 温度对SS、PA和NR影响的SNK检验 Table 3 SNK test about SS, PA and NR in different temperature

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 SS、PA和NR差异的双因子方差分析 Table 4 Two-factor variance analysis about SS, PA and NR 变异来源 Source 项目 Item 可溶性糖 SS 丙酮酸 PA 硝酸还原酶 NR 总处理Corrected model F 4.43 3.57 4.72 P 0.013 0.026 0.008 温度Temperature F 4.37 2.84 8.75 P 0.003 0.042 < 0.001 性别Sex F 3.67 3.85 0.57 P 0.025 0.045 0.912 互作间Interaction F 1.12 1.34 1.12 P 0.306 0.337 0.454

表4 SS、PA和NR差异的双因子方差分析 Table 4 Two-factor variance analysis about SS, PA and NR

♀株中SOD和POD含量显著高于♂株(P< 0.05)(表5), CAT在性别间无差异。温度对3种抗氧化酶活性有显著影响(P< 0.05), 随温度降低3种酶活性不断增加, ♀株中SOD和POD增加速度大于♂株。SOD和POD在3个温度间有显著差异(P< 0.05), CAT在25和20 ℃时差异较小。从25 ℃到20 ℃, SOD活性增加了30%左右, POD活性增加了3倍左右, CAT活性无显著增加; 从20 ℃到15 ℃, SOD活性增加了约6倍, POD活性增加了约80%, CAT活性增加了约50%。

性别对SOD和POD活性有显著影响(P< 0.05), 对CAT活性影响不显著 (表6)。温度对SOD和POD活性有极显著影响(P< 0.01), 对CAT活性有显著影响(P< 0.05)。温度对抗氧化酶活性的影响远大于性别, 温度和性别对SOD活性有显著交互作用(P< 0.05)。性别和温度对抗氧化酶活性影响均为SOD> POD> CAT。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 温度对抗氧化酶活性指标影响的SNK检验 Table 5 SNK test about antioxidant enzyme activity index in different temperature 温度 Temperature (℃) 性别 Sex 超氧化物歧化酶活性 Superoxide dismutase activity (SOD, U/min· g) 过氧化物酶活性 Peroxidase activity (POD, U/min· g) 过氧化氢酶活性 Catalase activity (CAT, U/min· g) 25 ♀ 102.17± 12.18Ac 40.65± 6.67Ac 247.25± 23.52Ab ♂ 98.65± 9.92Bc 39.17± 3.37Bc 272.71± 8.91Ab 20 ♀ 143.17± 11.32Ab 132.15± 15.85Ab 227.15± 15.38Ab ♂ 128.24± 13.58Bb 108.34± 11.53Bb 254.18± 9.64Ab 15 ♀ 862.15± 58.54Aa 262.17± 9.48Aa 378.57± 8.54Aa ♂ 608.36± 39.48Ba 181.45± 5.25Ba 347.48± 14.65Aa

表5 温度对抗氧化酶活性指标影响的SNK检验 Table 5 SNK test about antioxidant enzyme activity index in different temperature

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 抗氧化酶活性指标差异的双因子方差分析 Table 6 Two-factor variance analysis about antioxidant enzyme activity index 变异来源 Source 项目 Item 超氧化物歧 化酶活性 SOD activity 过氧化物 酶活性 POD activity 过氧化氢 酶活性 CAT activity 总处理 Corrected model F 88.44 72.25 2.43 P < 0.001 < 0.001 0.081 温度 Temperature F 169.15 9.07 4.37 P < 0.001 < 0.001 0.021 性别Sex F 4.12 3.56 1.67 P 0.012 0.015 0.602 互作间 Interaction F 3.82 1.62 1.12 P 0.017 0.351 0.431

表6 抗氧化酶活性指标差异的双因子方差分析 Table 6 Two-factor variance analysis about antioxidant enzyme activity index

性别对细胞膜完整性指标有显著影响, ♂株中H₂O₂和SP含量显著高于♀株(P< 0.05)(表7), ♀株中MDA和Pro含量显著大于♂株。温度对细胞膜完整性指标均有显著影响, 随温度降低H₂O₂、MDA、Pro和SP含量均显著增加。25 ℃到20 ℃, H₂O₂、MDA和SP含量显著增加。 20 ℃到15 ℃, Pro和SP含量显著增大。15 ℃时H₂O₂、MDA、Pro和SP含量比25 ℃时增加了约1.5倍。随温度降低♂株的H₂O₂和Pro增加量大于♀株, ♂株和♀株的MDA和SP增加量相近。

方差分析说明, 性别间H₂O₂、MDA、Pro和SP含量均有显著差异(P< 0.05), 温度间4种物质含量均有极显著差异(P< 0.01)。温度对细胞膜完整性物质含量的影响远大于性别, 温度和性别对4种物质含量无显著交互作用(P> 0.05)。性别对细胞膜完整性物质含量的影响为SP> MDA> H₂O₂> Pro, 温度的影响为Pro> SP> H₂O₂> MDA(表8)。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 温度对细胞膜完整性指标影响的SNK检验 Table 7 SNK test about cell membrane integrity index in different temperature 温度 Temperature (℃) 性别 Sex 过氧化氢含量 H2O2 (mmol/g) 丙二醛含量 Malondialdehyde content (MDA, μ mol/g) 游离脯氨酸含量 Free proline content (Pro, μ g/g) 可溶性蛋白含量 Soluble protein (SP, mg/g) 25 ♀ 105.34± 24.71Bb 24.17± 12.18Ab 19.79± 3.45Ab 10.45± 3.65Bc ♂ 237.54± 21.50Ab 30.56± 9.92Bb 15.78± 2.74Bb 13.15± 3.27Ac 20 ♀ 537.41± 17.54Ba 57.16± 11.32Aa 21.85± 4.57Ab 22.14± 2.05Bb ♂ 675.42± 18.52Aa 59.67± 13.58Ba 15.63± 1.42Bb 28.33± 1.53Ab 15 ♀ 517.54± 75.14Ba 59.47± 58.54Aa 35.12± 8.75Aa 42.77± 7.45Ba ♂ 678.13± 56.17Aa 77.24± 39.48Ba 30.59± 6.35Ba 48.43± 5.27Aa

表7 温度对细胞膜完整性指标影响的SNK检验 Table 7 SNK test about cell membrane integrity index in different temperature

表8

Table 8

表8(Table 8)

表8 细胞膜完整性指标差异的双因子方差分析 Table 8 Two-factor variance analysis about cell membrane integrity index 变异来源 Source 项目 Item 过氧化氢 H2O2 丙二醛 MDA 游离脯 氨酸 Pro 可溶性蛋白 Soluble protein 总处理Corrected model F 71.45 88.44 56.67 72.25 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 温度Temperature F 8.14 6.35 10.57 9.07 P 0.003 0.006 < 0.001 < 0.001 性别Sex F 2.87 4.12 2.72 6.56 P 0.041 0.031 0.042 0.015 互作间 Interaction F 0.97 1.28 1.07 1.62 P 0.989 0.727 0.851 0.351

表8 细胞膜完整性指标差异的双因子方差分析 Table 8 Two-factor variance analysis about cell membrane integrity index

光合作用实质是植物在系统性酶等生理活性物质促进下, 通过叶绿素吸收、固定光能, 经过复杂的系列反应把光能转变为化学能的过程。叶绿素是光合作用的物质基础, 其含量及组成极易受生境的影响。觅到合适的支持物可显著增加葎草叶绿素含量^[16], 轻、中度水分胁迫也显著增加了叶绿素含量^[17], 且增加值无显著性别差异, 但重度胁迫下, ♂株的叶绿素含量比♀株下降幅度更大。有研究认为在低温下酶活性降低, 叶绿素合成受阻且加速降解, 使叶绿素含量降低^[18]。本试验中, 温度对葎草叶绿素含量有显著影响, 随温度降低叶绿素含量并非线性下降, 15 ℃时叶绿素含量显著高于20 ℃, 也许15 ℃未达叶绿素降解低温强度, 但限制了叶片开展, 造成叶绿体等细胞器密度增大, 而使叶绿素含量增加。在支持物、水分、温度胁迫时叶绿素含量无显著性别差异, 而♀株的P_n总是显著大于♂株, 致使♀株的单株生物量显著大于♂株, 因♀株承担孕育子实的任务, 高效的光能捕获和利用能力对生殖成功及后代传播具有重要意义。随温度下降葎草的P_n显著下降, 温度对光合作用的影响较为复杂, 主要通过酶的活性和气孔开合度, 影响酶促反应速度和气体通量, 致使光合作用底物浓度和反应速度发生改变。可通过胞间CO₂浓度(C_i)与气孔导度(G_s)数值变化一致性, 判断气孔是否参与光合速率调节^[19], ♀株在有限的叶绿素基础上, 是否通过气孔调节提升其光合速率有待深入研究。温度下降10 ℃, P_n值可降低50%左右, 本文中15 ℃时葎草的P_n值显著低于其他温度, 其潜在光合速率则显著大于其他温度, 说明低温虽限制了光合酶的活性, 但累积了最高的叶绿素浓度。可见在长期低温环境下, 葎草形成了更为复杂的系统性光合策略, 若外界温度一旦提升, 即可激发其光合补偿机制或光合潜力, 增加植株生长发育和存活几率。

可溶性糖(SS)是主要光合产物, 是碳水化合物代谢、暂时贮藏和运输的主要行式, 也是呼吸作用的主要底物, 与植物的抗性有密切关系^[12]。植物生长发育实质是可溶性糖经过复杂的合成、分解及转运, 转化为结构性物质、生理活性物质及贮藏性物质的过程。温度通过影响光合作用和呼吸作用中系列酶的活性, 影响SS的合成与分解, 也通过影响蒸腾作用和细胞膜的完整性, 改变SS的运转和累积。本文中, 温度越低P_n值越小, 表明SS的合成越慢, 温度越低呼吸作用产物丙酮酸(PA)含量越高, 表明SS分解越快, 但SS含量逐步增加, 可见葎草能够依据温度在生长、生殖和抵御功能间进行物质和能量的权衡性分配, 结果与支持物和水分胁迫下相似。3个温度下♂株P_n显著低于♀株, 而SS和PA含量均显著高于♀株(P< 0.05), 不仅说明♂株的同化作用比♀株更易受温度的影响, 且♂株把更多的物质与能量用于抵御生境的胁迫, 致使其生物量累积、植株大小、分枝能力低于♀株^[17]。硝酸还原酶(NR)活性对无机氮的还原、同化和氨基酸、蛋白质的合成等氮代谢过程起关键的调控作用^[20], 氮代谢与糖代谢和呼吸作用密切相关, 约25%光合总能量用于氮代谢^[21]。温度越低SS和PA含量越高, 而NR活性越低, 表明氮素代谢受温度影响较大, 但未与增强抵御性的糖代谢和呼吸作用同步跟进。3个温度下♂株和♀株的NR活性无显著差异, NR活性与P_n呈现出一致性, 或因氮代谢受氮源种类、生态因子、发育阶段以及部位诸多因子的影响^[22], 或在胁迫条件下氮代谢主要参与维持生命运转的遗传物质和生理活性物质合成, 降低了与糖代谢和呼吸作用的相关性。温度对糖代谢、氮代谢及呼吸作用的影响是极其复杂的系统性过程, 本文通过SS和PA含量及NR活性变化, 仅说明温度对葎草物质代谢速度的性别差异, 说明♂株比♀株承受更大的生存风险。

正常植物组织中通过各种途径产生活性氧(active oxygen)的同时, 也通过抗氧化酶系统来降低或消除活性氧对膜脂的攻击能力, 使细胞内自由基的产生和清除处于动态平衡状态。随温度降低葎草中SOD、POD 和CAT活性不断增加, 25 ℃到20 ℃, SOD增加30%左右, POD增加3倍左右, CAT无显著增加; 从20 ℃到15 ℃, SOD增加了6倍左右, POD增加了80%左右, CAT增加了50%左右。可见温度对抗氧化酶系统的组成和比例有显著影响, 或许不同温度对活性氧产生途径、产生器官和产生量有影响。SOD消除H₂O₂的产生, CAT分解H₂O₂, 而POD主要定向分解叶绿体中的H₂O₂。20 ℃时, 叶绿素显著下降, POD急剧增加, CAT无变化, 表明活性氧主要由叶绿体的代谢产生。15 ℃时, 3种酶活性均显著增加, 尤其SOD急剧上升, 表明H₂O₂产生途径及产生量更为复杂。♀株中SOD和POD含量显著高于♂株, CAT性别间无差异, 一方面说明♀株的抗氧化能力强于♂株, 一方面说明葎草应对外界胁迫的保护酶系统相当复杂。本实验设置的3个温度下, 抗氧化酶活性存在数倍的差异, 尤其长期处于恒温条件, 葎草均能合理配置资源且协调生长^[23], 说明葎草具有极其强大的适应环境能力。

当胁迫导致产生的活性氧超过保护酶系统的清除能力, 导致细胞膜透性增大, 损伤大分子生命物质, 引起系列生理紊乱, 导致植物受伤。本文中♂株中H₂O₂含量显著高于♀株, 说明♂株细胞膜受到伤害的风险更大。♀株中抗氧化酶活性高, 但表征膜脂过氧化作用的最终产物MDA显著大于♂株。♂株通过提高SS和SP含量增加细胞水势, 减弱H₂O₂引起的细胞脱水, ♀株通过提高Pro含量维持细胞渗透压。细胞膜完整性指标呈现出显著的性别差异, 或许♀株和♂株细胞膜对温度胁迫响应时间及抗性潜力存在差异, 有研究表明♂株对水分胁迫响应早于♀株, 但抗旱潜力低于♀株^[12]。同时♀株和♂株采用了不同调节细胞渗透压的方式, 随温度降低♂株的H₂O₂和Pro增加量大于♀株, ♂株和♀株的MDA和SP增加量相近, 总体上♂株中H₂O₂、SS和SP含量显著高于♀株, ♀株中MDA和Pro含量显著大于♂株, 表明♀株和♂株产生、消除活性氧途径存在差异, 或许细胞膜对活性氧伤害的抵抗方式及应对机理存在不同。温度对葎草细胞膜有显著影响, 温度越低引起细胞膜伤害的H₂O₂含量越高, 但维持渗透压物质和表征伤害度的物质均逐步增加, 且性别主要影响SP含量, 温度主要影响Pro含量, 到底♀株和♂株在不同温度下采用了怎样的应对机理, 有待深入研究。