采用盆栽试验, 于2014年在位于湖南省长沙市岳麓区的中国农业科学院麻类研究所温室进行。供试的苎麻基因型为前期水培试验, 从30个苎麻资源中筛选出氮低效基因型册亨家麻和氮高效基因型H2000-03, 其中册亨家麻在9 mmol/L氮素营养液中的氮素利用效率为15.81%, H2000-03为46.01%。

选取生长状况一致的、嫩梢扦插培育的种苗进行试验。采用盆栽试验, 每盆一株。试验塑料盆直径60 cm, 高55 cm, 每盆装干土30 kg。盆栽用土壤自然风干、过筛去杂后装盆, 用水沉实, 土壤最大持水量为63.8%, 土壤养分含量为:全氮1.01 g/kg, 速效氮75.1 mg/kg, 速效磷16.25 mg/kg, 速效钾37.41 mg/kg, 有机质含量2.35 mg/kg。

试验设5个处理, 用氮素水平分别为0、6、9、12、15 mmol/L的营养液浇灌, 代号分别为N₀、N₆、N₉、N₁₂和N₁₅, 每个处理3个重复, 每个重复15株。为避免水分胁迫影响, 每3 d浇300~500 mL营养液, 在第3天上午8:00-10:00一次性完成, 各处理浇灌量一致。营养液的全生育期60 d, 共浇灌20次, 总灌水量为8 L。大量元素营养液配方参考Hoagland营养液配方, 微量元素营养液配方参考[21], 具体见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 大量元素培养液配方 Table 1 Components of mass elements in nutrient solutionmg/L 盐类Salts N0 N6 N9 N12 N15 Ca(NO3)2· 4H2O - 708.45 826.53 1180.75 1180.75 KNO3 - 95.14 202.20 202.20 505.20 KCl - - 223.65 223.65 - K2SO4 435.65 361.92 - - - KH2PO4 136.07 136.07 136.07 136.07 136.07 MgSO4· 7H2O 492.96 492.96 492.96 492.96 492.96 CaCl2 554.90 221.96 166.47 - -

表1 大量元素培养液配方 Table 1 Components of mass elements in nutrient solutionmg/L

2014年5月10日将苎麻扦插苗移栽至花盆中, 用清水浇灌培养至7月14日, 剪除地上部进行破秆, 正式开始氮素处理试验。分别在幼苗期(第15天, 7月29日)、旺长期(第40天, 8月23日)、成熟期(第54天, 9月6日)取样, 取样时间为上午10点, 取样部位为从顶部数第3~8片功能叶和植株中部韧皮组织, 先用液氮固定30 s, 然后放入-80 ℃冰箱中保存, 用以测定样品相关酶活性, 每个样品3个重复。每隔6 d测定一次苎麻株高, 测定时间为上午9点, 测定方法为地面至主茎叶尖的拉直长度, 测定全部植株后平均, 观察苎麻生长动态。至60 d, 收获苎麻, 并测定鲜重。目前饲用苎麻以利用鲜株为主, 因此本研究选取鲜重为产量指标。

收获后对整个植株称取鲜重。之后用自来水和蒸馏水冲洗干净, 将植株在105 ℃下杀青30 min, 再将温度调到75 ℃烘干24 h, 最后用粉碎机粉碎。粉碎后的样品经H₂SO₄-H₂O₂消化后^[15], 对样品中的蛋白质含量按GB/T 6432-1994进行测定。

酶活性的测定, 谷氨酸合成酶(GOGAT)活性测定参照郑朝峰等^[22]的方法; 硝酸还原酶(NR), 谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量参照《现代植物生理学实验指南》^[23]; 过氧化氢酶(CAT)活性用H₂O₂紫外吸收法测定^[24]。

运用模糊隶属函数法进行排序, 隶属函数公式为:R(X_i)=(X_i-X_min)/(X_max-X_min), 其中X_i代表指标测定值, X_min和X_max代表某一指标的最小值和最大值。

采用Microsoft Excel 2016对所得到的数据进行初步整理和图表绘制, 用IBM SPSS statistics 19.0软件进行方差分析和一般线性相关分析。采用Duncan法在0.05和0.01水平上进行多重比较。

从苎麻株高的动态变化特征可以看出(图1), 两个不同氮效率的苎麻基因型在0~18 d生长速率较为一致, 不同氮素水平下没有显著差异。从6 d开始, 苎麻生长速率迅速提升, H2000-03在不同氮素水平下的株高增长速率较册亨家麻平均高22.9%, 最大达到33.3%。从18 d开始, 施氮与不施氮(N₀)相比株高差异迅速加大, 且氮高效基因型H2000-03株高增长显著高于氮低效基因型册亨家麻。至60 d收获时, H2000-03在N₀、N₆、N₉、N₁₂和N₁₅处理下的株高分别较册亨家麻高40.1%、71.4%、27.4%、97.6%和73.8%。

分析不同氮素水平下苎麻鲜重产量可知(图2), 在0~9 mmol/L的范围内, 随着氮素水平的提高, 苎麻鲜重显著增加(P< 0.01)。超过9 mmol/L后, H2000-03维持了较高的产量, 而册亨家麻则显著下降(P< 0.01)。5个氮素水平下H2000-03的鲜重均显著高于册亨家麻。可见, 氮高效基因型一方面能够适应较高氮素水平, 另一方面能够通过获得更高的产量而显著提升氮素利用效率。

两个基因型苎麻的叶片蛋白质含量均随氮素水平的提高而提高。H2000-03叶片蛋白质含量在N₉、N₁₂和N₁₅处理下没有显著差异, 但均极显著高于N₆和N₀处理, N₆处理又极显著高于N₀处理。册亨家麻叶片蛋白质含量随氮素水平提高的增长趋势与H2000-03相似, 但在低氮素水平(N₀~N₉)的增长率较低, 而在高氮素水平(N₉~N₁₅)的增长率较高, 其中N₉处理相对于N₀处理册亨家麻增长29.0%, 小于H2000-03的65.8%; N₁₅处理相对于N₉处理册亨家麻增长10.6%, 大于H2000-03的6.2%。

图1

Fig.1

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	图1 不同氮素水平下苎麻株高动态变化Fig.1 Dynamic of plant height of ramie at different nitrogen levels

图2

Fig.2

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	图2 不同氮素水平对单株苎麻鲜重和叶片蛋白质含量的影响 同一基因型不同小写字母表示在P< 0.05水平差异显著性(t测验), * 表示两个基因型在同一氮素水平下差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.2 Effects of different nitrogen levels on fresh yield of single ramie plant and its leaf protein content Small letters indicate significant difference among nitrogen levels (P< 0.05), * indicate significant difference between genotypes at the same nitrogen level (P< 0.05). The same below.

NR活性随苎麻生长时间表现出先升高后降低的现象, 而各时期内均表现为随氮素水平的增加而逐渐升高的现象(图3)。H2000-03的NR活性在幼苗期和旺长期提高比率高于册亨家麻, 其中幼苗期两个基因型NR活性N₁₅较N₀分别提高80.2%和76.2%, 旺长期则分别提高126.4%和74.7%。成熟期N₀处理下册亨家麻NR活性仅为29.36 μ g/(g· h), 其随氮素浓度提高的增长比率较大。比较两个基因型的差异发现, 氮高效基因型H2000-03在所有处理和生育时期均高于氮低效基因型册亨家麻, 且在旺长期和成熟期的N₁₅处理下达到显著差异(P< 0.05)。

GS活性随苎麻生长时间也表现出先升高后降低的现象, 而在3个生长时期内则表现为随氮素水平的提高呈现先升高后缓慢降低的趋势(图4)。H2000-03各生长阶段苎麻GS活性均在N₉处理下达到最大值, 并在较高浓度氮素处理间保持了较高的水平和比册亨家麻更缓和的变化幅度, 尤以旺长期明显。册亨家麻则表现为在N₁₂处理下达到最大值, 说明氮低效基因型苎麻需要更高浓度的氮素来促进GS活性的提高。至成熟期, H2000-03的GS活性在低浓度氮素条件下(N₀、N₆)显著较高, 而在高浓度氮素条件下(N₉、N₁₂、N₁₅)显著较低(P< 0.05)。在同一氮素水平上, 幼苗期和旺长期表现为H2000-03显著高于册亨家麻。

GOGAT活性随苎麻生长时间的变化趋势与GS活性相似, 表现出先升高后降低的现象, 但各生长时期内仅H2000-03表现为随氮素水平的提高呈现先升高后降低的趋势(图5)。册亨家麻在各生长时期内的变化规律不一致, 其GOGAT活性变化幅度随苎麻生长推进逐步变小, 至成熟期, 不同氮素水平间没有显著差异。两个基因型在N₉、N₁₂处理下达到GOGAT活性的最大值。H2000-03较册亨家麻不仅在生育期内GOGAT活性较高, 还表现出对氮素水平更敏感的特征。

图3

Fig.3

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	图3 不同氮素水平对各生长时期苎麻硝酸还原酶(NR)活性的影响Fig.3 Effects of different nitrogen levels on nitrate reductase (NR) activity of ramie at different growth periods

图4

Fig.4

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	图4 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酰胺合成酶(GS)活性的影响Fig.4 Effects of different nitrogen levels on glutamine synthetase (GS) activity of ramie at different growth periods

图5

Fig.5

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	图5 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酸合成酶(GOGAT)活性的影响Fig.5 Effects of different nitrogen levels on glutamate synthase (GOGAT) activity of ramie at different growth periods

各生长时期册亨家麻的GLDH活性往往显著高于H2000-03(图6)。各时期内苎麻GLDH活性均表现为随着氮素水平升高逐渐增大的趋势, 但当氮素浓度> 9 mmol/L时, 变化趋于平缓, N₉、N₁₂和N₁₅处理间均没有显著差异。GLDH活性随苎麻生长时间的推进表现出逐渐增加的趋势, 其中H2000-03和册亨家麻在N₉处理下成熟期较幼苗期分别增加88.7%和85.8%, N₁₅处理分别增加109.7%和112.8%。

由表2可以看出, 在幼苗期和成熟期, 苎麻叶片蛋白质含量与GLDH、NR活性显著(P< 0.05)或极显著(P< 0.01)正相关, 而与GS、GOGAT活性相关不显著。旺长期苎麻叶片蛋白质含量则与GS、GOGAT和NR活性显著正相关, 而且各个酶的活性均显著或极显著正相关。NR活性在各个时期均与叶片蛋白质含量呈显著正相关关系。

图6

Fig.6

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	图6 不同氮素水平对各生长时期苎麻谷氨酸脱氢酶(GLDH)活性的影响Fig.6 Effects of different nitrogen levels on glutamic dehydrogenase (GLDH) activity of ramie at different growth periods

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同氮素水平叶片蛋白质含量与氮代谢相关酶活性间的相关系数 Table 2 The correlation coefficient of leaf protein content and enzyme activity related to nitrogen metabolism at different nitrogen levels 生育时期 Growth periods 酶 Enzyme 叶片蛋白质含量 Leaf protein content GS GOGAT GLDH 幼苗期 Seedling stage GS 0.2360 GOGAT 0.4884 0.5312 GLDH 0.7827* * 0.5624 0.4540 NR 0.8200* * 0.6397* 0.5040 0.9233* * 旺长期 Maximum growth GS 0.7816* * GOGAT 0.6570* 0.9060* * GLDH 0.5937 0.8941* * 0.9265* * NR 0.7032* 0.7575* 0.8802* * 0.8017* * 成熟期 Maturity GS 0.6049 GOGAT 0.0898 -0.4097 GLDH 0.6566* 0.8722* * -0.4484 NR 0.9146* * 0.5164 0.2807 0.6140 NR: 硝酸还原酶Nitrate reductase; GS: 谷氨酰胺合成酶Glutamine synthetase; GOGAT: 谷氨酸合成酶Glutamate synthase; GLDH:谷氨酸脱氢酶Glutamic dehydrogenase.* P< 0.05. * * P< 0.01.

表2 不同氮素水平叶片蛋白质含量与氮代谢相关酶活性间的相关系数 Table 2 The correlation coefficient of leaf protein content and enzyme activity related to nitrogen metabolism at different nitrogen levels

两个基因型苎麻CAT活性随氮素水平的提高均表现出明显的先升高后下降的趋势, 并在N₉处理下达到最大值(图7)。H2000-03在各生长时期均高于册亨家麻。N₆、N₉、N₁₂下两者之间差异往往大于N₀、N₁₅, 其中旺长期N₆处理下两者存在显著差异(P< 0.05), N₉、N₁₂处理下H2000-03分别为册亨家麻的21.4%和23.2%, 而N₀、N₁₅处理下差异均小于10%。

两个基因型苎麻的SOD活性随生长时间推进在低氮水平下整体表现增加, 而在高氮水平下整体表现降低的趋势(图8)。在各生长阶段内, 随着氮素水平的提高, H2000-03整体表现为升高趋势, 而册亨家麻表现为先升高后降低的趋势。幼苗期和旺长期, H2000-03的SOD活性在低氮水平低于册亨家麻, 而在高氮水平下相对较高; 成熟期则均低于册亨家麻。

两个基因型苎麻POD活性在3个生长时期随着氮素水平的提高均呈现先升高后下降的现象, 同一氮素水平下POD活性具有相同的变化特征(图9)。两个基因型在3个时期均表现为N₉处理时呈现最大值, 且显著高于其他处理(P< 0.05)。两个基因型间的差异与SOD相似, 表现为幼苗期和旺长期, H2000-03的在低氮水平低于册亨家麻, 而在高氮水平下较高; 成熟期则均低于册亨家麻。

图7

Fig.7

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	图7 不同氮素水平对不同时期苎麻CAT活性的影响Fig.7 Effects of different nitrogen levels on catalase (CAT) activity of ramie at different growth periods

图8

Fig.8

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	图8 不同氮素水平对不同时期苎麻SOD活性的影响Fig.8 Effects of different nitrogen levels on superoxide dismutase (SOD) activity of ramie at different growth periods

图9

Fig.9

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	图9 不同氮素水平对不同时期苎麻POD活性的影响Fig.9 Effects of different nitrogen levels on peroxidase (POD) activity of ramie at different growth periods

运用模糊隶属函数法, 计算上述8个相关酶活性的隶属度函数值, 进行排序后发现, 两个基因型苎麻在不同氮素水平下的平均隶属度函数值排序均表现为N₉> N₁₂> N₁₅> N₆> N₀(表3)。可见, 苎麻对氮素的需求具有最适水平, 较低或者较高均显著影响到苎麻氮代谢及抗性相关酶活性, 进而会降低氮素利用效率。相对于低氮水平, 苎麻更容易在高氮水平下表现出较强的氮代谢能力。结合苎麻株高和产量数据, 进一步验证了这个结论。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 旺长期苎麻若干生理变化影响的综合评价 Table 3 Comprehensive assessment on several physiological changes of ramie at rapid growth phase 基因型 Genotypes 处理 Treatments 隶属度函数值 Membership function value 平均值 Mean 排序 Order NR GS GOGAT GLDH CAT SOD POD H2000-03 N0 0 0 0 0 0.100 0 0.031 0.019 5 N6 0.447 0.388 0.445 0.202 0.332 0.134 0 0.278 4 N9 0.407 0.969 0.711 1 1 0.878 1 0.852 1 N12 0.646 0.964 1 0.821 0.348 1 0.443 0.746 2 N15 1 1 0.879 0.890 0 0.720 0.196 0.669 3 册亨家麻 Ceheng Jiama N0 0 0 0.041 0 0.157 0.035 0 0.033 5 N6 0.181 0.193 0 0.272 0 0 0.141 0.112 4 N9 0.689 1 0.872 0.687 1 0.930 1 0.883 1 N12 0.855 0.943 1 0.735 0.131 1 0.324 0.713 2 N15 1 0.479 0.982 1 0.389 0.713 0.099 0.666 3

表3 旺长期苎麻若干生理变化影响的综合评价 Table 3 Comprehensive assessment on several physiological changes of ramie at rapid growth phase

株高、鲜重和蛋白质含量是表征饲草生长速率、产量和品质的重要指标。研究得出, 氮高效基因型苎麻在同一氮素水平下的生产力、氮素胁迫条件下的稳产性上均优于较氮低效基因型, 具体表现在同一氮素水平下较高的株高、鲜重, 适宜氮素水平下的叶片蛋白质含量及在持续提高氮素水平时稳产的特性上。研究还发现, 苎麻对氮素的需要存在最适量, 低于或高于最适水平将导致显著的产量降低或报酬递减现象, 适宜氮素水平下不仅可获得氮肥投入与产量、品质的契合。这与文中对氮代谢及抗性相关酶的分析结果是一致的。

本研究采用的是盆栽试验, 较严格地控制了温度、土壤水分和营养供给等条件, 在对比不同氮素水平处理和苎麻基因型间的差异中可获得更客观的数据。但这与大田复杂的影响因素不同, 因此进一步研究还须综合考虑多因素的互作。同时, 盆栽试验针对单株苎麻, 忽略了作物群体内的竞争关系及综合表现等因素, 还需要进一步的研究来论证。

NR是硝酸氮同化的限速酶和调节酶, 对植物吸收氮素至关重要, 其活性的大小受植物体内氮素影响显著。胡润芳等^[25]用不同形态氮素处理大豆(Glycine max), 发现大豆花荚期高蛋白品种功能叶片中NR活性高于低蛋白大豆品种。张磊等^[26]的研究得出了相似的结论。本研究中NR活性随着氮素水平增加而持续升高, 而且两个基因型的差距越来越大, 并在生长中后期的N₁₅处理下差异显著(P< 0.05)。表明氮高效基因型具有对氮素高吸收高转化能力, 而且更高的施氮水平能够促进苎麻NR活性的提高。

GS/GOGAT是高等植物体内氨同化的主要途径^{[14, 27]}, 可以把无机氮转化为有机氮, 作为氨的贮存库, 可以形成有机氮形式的有效转化, 解除植物体内多余的氨态氮。GS是氮代谢中心的多功能酶, 参与多种氮代谢的调节, GOGAT可以直接反映氨同化的强弱^[28]。张国英^[29]对水稻(Oryza sativa)碳氮代谢关键酶的研究表明, 随着氮素的增加, GS活性不断升高, 加速了无机氮的转化, 在品种间和氮素水平处理间均表现为显著性差异; 在高氮条件下, GOGAT活性升高增加了谷氨酸的合成, 加强了体内氮素代谢, 低氮条件下, 侧重于增加氮素的吸收。本研究结果表明, 苎麻在幼苗期和旺长期GS和GOGAT活性随着氮素水平提高而增加, 说明此时对氨的同化较为活跃, 氮高效基因型GS和GOGAT酶活性更强, 主要表现为氮素的形式转化, 成熟期后活性降低较为明显, 说明随着植物叶片的衰老, 其GS和GOGAT活性下降, 氨同化合成受阻。H2000-03的GS和GOGAT活性高于册亨家麻, 表明氮高效基因型具有更高的无机氮转化成有机氮的能力。

GLDH具有对GS/GOGAT循环的辅助作用。张国英^[29]对水稻在低氮和高氮条件下对GLDH活性研究表明, 由于GLDH对氨的亲和力较低, 在氨同化作用中发挥的作用较小, GS/GOGAT循环在体内发挥主要作用, 减少GLDH作用, 可减少能量消耗。本研究发现苎麻H2000-03的GLDH活性较册亨家麻低, 可见氮高效基因型更节约氮代谢的能量, 而且氮低效基因型苎麻的GS/GOGAT循环能力较弱, 需要通过GLDH增加对氨的吸收, 来辅助苎麻对氮素的利用。GLDH活性也是随着氮素水平升高和生长时间推进均表现出增加的趋势, 说明随着苎麻的生长, 需要越来越强的GLDH活性来加强氮的吸收。

张智猛等^[30]对花生(Arachis hypogaea)叶片可溶性蛋白质含量与GS、GLDH和NR活性的关系研究表明, 可溶性蛋白含量与GS和GLDH活性间的相互关系均不明显, 但与NR活性达到显著(P< 0.05)或极显著(P< 0.01)水平。李晶等^[31]研究表明, 小黑麦(Triticale rimpau)花后各时期, 旗叶可溶性蛋白含量与NR和GS活性呈极显著(P< 0.01)正相关, 增施氮肥可以增强小黑麦花后叶片对氮素的同化能力, 而GS活性与蛋白质合成关系密切, GS活性越高越有利于蛋白质合成^[32]。也有研究表明NR活性的增加可以诱导GS和GLDH酶活性的提高^[33]。本研究发现, 苎麻生长较弱的幼苗期和成熟期, 其叶片蛋白质含量与GLDH、NR活性显著相关, 在旺长期则与GS、GOGAT和NR活性显著或极显著正相关, 而且各个酶的活性均显著或极显著正相关。旺长期是决定苎麻产量的关键时期, 将该时期的氮代谢相关酶作为高蛋白苎麻品种的选育指标之一, 有利于提高苎麻的氮素利用效率和生产性能。

CAT、SOD和POD的高低可以衡量作物在逆境条件下的适应能力, 间接通过改善植物的生理状况而增强作物氮代谢能力, 提高产量和品质^{[34, 35]}。谢美玲^[36]通过提高氮素水平增加了烤烟苗期叶片中CAT的活性, 降低了MDA的含量, 减轻了烟株膜脂氧化程度, 并认为高氮水平处理可增加叶片SOD活性, 延缓了叶片的衰老, 利于烤烟苗期的生长。本研究结果表明, 各时期苎麻CAT、SOD、POD随氮素水平的提高有先上升后下降的趋势, 并在N₉处理时达到最大值, 这与王贺正等^[37]的研究结果相似, 说明合理施用氮肥可以提高抗氧化酶活性, 增强苎麻对逆境的抵抗能力, 延长叶片功能期, 但施氮过量对抗氧化酶活性将起到抑制作用。刘连涛等^[27]研究表明从盛铃末期开始, 与中氮、高氮相比, 低氮处理棉花(Gossypium hirsutum)的SOD和POD活性降低, 组织含水量和干物质积累量快速下降, 而MDA含量快速升高, 加速了棉株衰老的进程。增加氮素营养能够明显提高叶片的生理活性, 延缓衰老。此研究结果与本研究中成熟期一致, 氮素水平能提高抗氧化酶活性, 有效清除体内活性氧, 延缓成熟期苎麻叶片衰老速度。

植物对氮素的生理生化反应受到许多因素的影响, 不同的生理生化指标对氮素的影响也不尽相同, 所以单个生理生化指标不能充分反映某一氮素浓度对其有害还是有利, 因此需对多个生理生化指标进行综合分析。本研究对苎麻氮代谢关键酶(直接因素)和抗性关键酶(间接因素)进行了比较分析, 并通过隶属函数法将影响苎麻氮代谢的两类因素, 进行综合分析, 有利于全面评价苎麻氮代谢能力。对旺长期苎麻的生理指标平均隶属函数值的比较, 氮高效和氮低效基因型在不同氮素浓度的平均隶属函数值均表现为N₉> N₁₂> N₁₅> N₆> N₀。可见苎麻在氮素代谢能力上存在较明显的最适水平, 较高或较低均会降低苎麻氮素代谢能力。苎麻更偏向于高氮水平与苎麻品种选育中长期以耐重肥为主要选择性状之一有关。

另外, 本研究的综合分析采用各项生理指标的平均隶属函数值为参考, 由于本研究的各项指标随氮素水平的提高变化规律较明显, 不会对结果产生影响, 但尚没有考虑到各指标的权重, 没有充分反映出不同氮素水平间的差距, 这需要进一步的分析方法创新。