内生细菌HX-2由作物逆境栽培生理与调控课题组从青岛崂山藿香植株叶片中分离获得, 现保存于青岛农业大学山东省旱作农业技术重点实验室。藿香种子采自青岛崂山, 经青岛农业大学农学与植物保护学院谭勇教授鉴定。牛肉膏蛋白胨培养基、金氏B液体培养基、Salkowsk显色剂、革兰氏染色液试剂盒、芽孢染色液试剂盒、Kovacs氏靛基质试剂盒以及有机磷细菌培养基购于青岛海博生物技术有限公司; 细菌基因组DNA快速抽提试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司, 2× Taq PCR MasterMix购自北京博迈德生物技术有限公司, 引物合成和PCR产物测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成, 其他试剂为国产分析纯。实验于2015年10月至2016年4月期间进行。

将内生细菌HX-2在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上30 ℃纯化培养24 h, 观察并描述菌落的形态、光泽、质地、边缘特征、表面特征、隆起形状及菌落颜色等特征。并按照革兰氏染色液试剂盒、芽孢染色液试剂盒说明书进行染色处理。将接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基30 ℃恒温180 r· min^-1摇培48 h的菌液收集, 进行16S rDNA分子鉴定, 重复3次。按照细菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书提取HX-2的基因组, 以此基因组为模板进行PCR扩增, 通用引物为27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), 总反应体系为20 μ L, PCR扩增条件: 94 ℃ 2 min, 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1.5 min, 30个循环; 72 ℃ 10 min后存于4 ℃。将 PCR 反应产物测序结果在GeneBank 上进行Blast 比对, 获得与目标菌株相似性较高的序列, 再用Clustalx比对, 采用MEGA 5.1工具构建NJ系统发育树。

将在金氏B液体培养基上30 ℃恒温180 r· min^-1摇培48 h的菌液按照Kovacs氏靛基质试剂盒说明书进行操作, 颜色变红表明内生细菌HX-2能产生吲哚乙酸, 颜色越深, 表明产生的吲哚乙酸越多, 重复3次。以吲哚乙酸标准品制作标准曲线, 将培养48 h的菌悬液和对照10000 r· min^-1离心10 min后取上清, 加入等体积的Salkowsk显色剂, 室温下避光显色 20 min, 测定其OD_{530 nm}吸光值。根据标准曲线计算内生细菌分泌吲哚乙酸的含量^[11]。将HX-2菌株点接于固体有机磷培养基上, 30 ℃培养 7 d, 观察有无溶磷圈, 并测定溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)的比值, 比值为 1 表示无解磷能力^[12], 重复3次。

1.4.1 耐酸碱性测定 将生长对数期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL pH为4, 5, 6, 7, 8, 9, 10的牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 30 ℃恒温摇床180 r· min^-1培养48 h, 测菌液OD_{600 nm}的吸光值, 以未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作对照, 重复3次。

1.4.2 耐盐性测定 将生长对数期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL NaCl含量为0.5%, 2.0%, 4.0%, 6.0%, 8.0%, 10.0%的牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 30 ℃恒温摇床180 r· min^-1培养48 h, 测菌液OD_{600 nm}的吸光值, 以未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作对照, 重复3次。

1.4.3 耐重金属铜测定 将生长对数期的HX-2菌液0.2 mL加入20 mL Cu²⁺含量为0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0 mmol· L^-1的牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 30 ℃恒温摇床180 r· min^-1培养48 h, 测菌液OD_{600 nm}的吸光值, 以未接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作对照, 重复3次。

1.5.1 种子萌发 将30 ℃恒温 180 r· min^-1 摇培48 h 的菌液, 10000 r· min^-1离心1 min留取上清液。挑选饱满健康、大小一致的藿香种子, 0.5% NaClO溶液消毒10 min后, 用无菌蒸馏水清洗3遍, 然后用吸水纸吸去种子表面浮水, 将消毒后的种子室温浸泡在上述上清液中12 h。采用纸床发芽, 在发芽盒底部垫两层发芽纸, 用无菌蒸馏水充分润湿后, 将浸泡后的种子整齐排放在发芽纸上, 之后盖上盒盖, 置于智能人工气候箱中进行发芽, 温度为30 ℃, 光照为10 h, 每处理3个重复, 每重复30粒种子。以未浸泡的种子和未接种菌体HX-2的培养基浸泡的种子为对照, 分别记作CK₁和CK₂。以后每天观察并统计发芽种子数, 于第4天统计发芽势(germination energy, GE), 第7天统计发芽率(germination rate, GR)^[13]。

GE=4 d内发芽种子数/供试种子数× 100%

GR=7 d内发芽种子数/供试种子数× 100%

1.5.2 幼苗生长 摇培48 h 后的菌液经4000 r· min^-1 离心5 min后, 保留菌体, 用无菌水调菌体浓度为 10⁸ cfu· mL^-1。营养土与粗粒蛭石按1:3的比例混匀, 经高温灭菌后称取100 g置于一次性方形小花盆中, 含水容积重量比为10%。将藿香种子播于其中, 每盆3粒种子, 出苗后只保留1株。出苗7 d后, 采用灌根法接种菌HX-2, 共设2个处理, 以不接菌的处理为对照, 每处理3次重复, 每重复10株苗。30 d后进行破坏性取样, 测藿香幼苗株高、根长、茎粗、叶面积、幼苗鲜重与干重、叶绿素含量和根系活力。幼苗株高、根长、茎粗采用游标卡尺测量, 叶面积采用方格纸法测量^[14], 幼苗鲜重与干重采用万分之一天平测量, 叶绿素含量采用日本美能达SPAD-502微型叶绿素仪测定, 用SPAD值表示^[15]; 根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)^[16]法测定。

采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析, Duncan法检验各参数不同处理间的差异显著性(P< 0.05)。

在牛肉膏蛋白胨固体培养基上30 ℃培养48 h, 菌落圆形扁平, 边缘整齐, 表面干燥, 灰白色, 中间有一皱点; 革兰氏染色和芽孢染色均呈阳性, 杆状, 芽孢呈椭圆形。在牛肉膏蛋白胨液体培养基上30 ℃培养48 h, 高度混浊, 表面无膜。以其基因组DNA为模板PCR扩增, 产物测序得片段大小为1459 bp。登录NCBI进行Blast比对, 选取10个相似度较高的菌株16S rDNA基因序列构建NJ系统发育树(图1), HX-2与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium(KC189946.1)聚在一个分支, 相似率达99.0%, 说明HX-2与该菌株亲缘关系最近。结合形态特征和16S rDNA基因序列分析结果, 判定HX-2为巨大芽孢杆菌, 命名为Bacillus megaterium strain HX-2。

图1

Fig.1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 菌株HX-2系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of strain HX-2

在含100 mg· L^-1色氨酸的金氏B液体培养基中, 加入该菌培养后Kovacs氏靛基质试剂变红, 说明内生菌HX-2具有产生吲哚乙酸的能力。Salkowsk显色后OD_{530 nm}为0.732, 由标准曲线方程y=0.021x+0.016 (R²=0.957, y代表吸光值, x代表浓度)计算得吲哚乙酸的含量为34.10 mg· L^-1。在有机磷细菌培养基平板上产生透明圈, 溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)的比值为1.3, 表明内生菌HX-2具有溶解有机磷的能力。

2.3.1 耐酸碱性 含盐量0.5%的牛肉膏蛋白胨液体培养基, 当pH为4时, 内生细菌HX-2不生长, 随pH值升高, OD_{600 nm}值越来越大且差异显著, 表明菌株逐渐生长旺盛; 当pH为8时, OD_{600 nm}值最大, 表明菌株此时生长最旺盛; pH值继续升高, OD_{600 nm}值显著下降, 表明菌株生长下降; 当pH为10时, 菌株生长最慢(图2)。可知, 菌株HX-2生长较旺盛的pH范围是5~9。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 pH对菌株HX-2生长的影响 不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)。下同。Fig.2 Effect of pH on strain HX-2 The different lowercase letters show significant difference at P< 0.05 level. The same below.

2.3.2 耐盐性 pH为8的牛肉膏蛋白胨液体培养基, 当NaCl含量为0.5%时, OD_{600 nm}值最大(图3), 表明此时内生细菌HX-2的生长最旺盛; 随NaCl含量的增加, OD_{600 nm}值呈下降趋势, 表明菌株逐渐生长变慢; 当NaCl浓度大于10.0%时, 菌株HX-2生长更慢或停止生长, 表明菌株HX-2具有一定的耐盐性, 耐盐范围为0.5%~8.0%。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 NaCl对菌株HX-2生长的影响Fig.3 Effect of NaCl on strain HX-2

2.3.3 重金属Cu²⁺耐性 pH为8的牛肉膏蛋白胨液体培养基, 随Cu²⁺含量增加, OD_{600 nm}值增大, 当Cu²⁺含量为1.0 mmol· L^-1时, OD_{600 nm}值最大(图4), 表明此时内生细菌HX-2的生长最旺盛; 随Cu²⁺含量的增加, OD_{600 nm}值呈下降趋势, 表明菌株生长逐渐变慢; 当Cu²⁺含量大于8.0 mmol· L^-1时, 菌株HX-2停止生长, 表明菌株HX-2具有一定的耐重金属Cu²⁺能力, 耐性范围为0~6.0 mmol· L^-1。

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 Cu2+对菌株HX-2生长的影响Fig.4 Effect of Cu2+ on strain HX-2

2.4.1 菌株HX-2对种子萌发的影响 与未浸泡处理的种子(CK₁)相比, 培养基浸泡(CK₂)和菌液浸泡(T)处理均能显著提高藿香种子的发芽势, 分别提高了8.06%和22.59%, 且培养基浸泡的种子和菌液浸泡的种子的发芽势存在显著差异(P< 0.05)。同样, 培养基浸泡(CK₂)和菌液浸泡(T)处理也能显著提高藿香种子的发芽率, 分别提高了6.18%和17.95%, 且培养基浸泡的种子和菌液浸泡的种子发芽率也存在显著差异(表1)。由此可知, 内生菌HX-2培养液浸种处理可以促进藿香种子萌发。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 菌株HX-2对藿香种子萌发的影响 Table 1 Effects of HX-2 on seed germination of A. rugosa 处理Treatments 发芽势GE (%) 发芽率GR (%) CK1 60.83± 0.96c 75.03± 1.33c CK2 65.73± 0.71b 79.67± 1.00b T 74.57± 0.87a 88.50± 0.95a Note: Data in same column followed by different letters indicate significant difference at P< 0.05. The same below. CK1:Control 1, seed unsoaked; CK2:Control 2, seed soaked with liquid medium; T:Treatment of strain HX-2. 注:同列不同字母表示差异显著(P< 0.05)。下同。CK1:未浸泡处理的种子; CK2:培养基浸泡处理的种子; T:菌液浸泡处理的种子。

表1 菌株HX-2对藿香种子萌发的影响 Table 1 Effects of HX-2 on seed germination of A. rugosa

2.4.2 菌株HX-2对幼苗生长的影响 未接种HX-2处理下, 藿香幼苗的株高、根长、茎粗、叶面积分别为8.14 cm、5.76 cm、0.48 cm和16.55 cm²; 接种HX-2处理下, 株高、根长、茎粗、叶面积分别为9.53 cm、6.81 cm、0.53 cm和18.98 cm², 分别提高了17.08%, 18.23%, 10.42%和14.68%, 且除茎粗外均有显著性差异(P< 0.05)。同样, 未接种HX-2处理下, 藿香幼苗的鲜重、干重为2.4254和0.2317 g· 株^-1, 接种HX-2处理下, 鲜重、干重为2.9781和0.2895 g· 株^-1, 显著提高了22.79%和24.95%。接种HX-2后, 叶绿素含量和根系活力分别由22.9(SPAD值)、9.01 μ g· g^-1 FW· h^-1提高至25.2(SPAD值)、10.74 μ g· g^-1 FW· h^-1, 分别提高了10.04%和19.20%, 且有显著性差异 (P< 0.05) (表2)。可见, 接种内生细菌HX-2可以促进藿香幼苗生长。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 菌株HX-2对藿香幼苗生长的影响 Table 2 Effects of HX-2 on seedling growth of A. rugosa 处理 Treatments 株高 Plant height (cm) 根长 Root length (cm) 茎粗 Stem diameter (cm) 叶面积 Leaf area (cm2) 鲜重 Fresh weight (g· plant-1) 干重 Dry weight (g· plant-1) 叶绿素含量 Chlorophyll content (SPAD) 根系活力 Root vigor (μ g· g-1 FW· h-1) CK 8.14± 0.24b 5.76± 0.31b 0.48± 0.09a 16.55± 0.89b 2.4254± 0.0721b 0.2317± 0.0072b 22.9± 0.6b 9.01± 0.49b CK+HX-2 9.53± 0.41a 6.81± 0.36a 0.53± 0.12a 18.98± 1.13a 2.9781± 0.0502a 0.2895± 0.0065a 25.2± 0.5a 10.74± 0.61a Treatment of strain HX-2. CK:对照组Control; CK+HX-2:接种内生细菌HX-2处理

表2 菌株HX-2对藿香幼苗生长的影响 Table 2 Effects of HX-2 on seedling growth of A. rugosa