苜蓿黄酮对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响
占今舜1,2, 陈小连2, 詹康1, 苏效双1, 赵国琦1,*
1.扬州大学动物科学与技术学院,江苏 扬州 225009
2.江西省农业科学院畜牧兽医研究所,江西 南昌 330200
*通信作者Corresponding author. E-mail:gqzhao@yzu.edu.cn

作者简介:占今舜(1985-),男,江西玉山人,博士。E-mail:zhanjinshun1985@163.com

摘要

研究苜蓿黄酮对脂多糖(LPS)诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。将奶牛乳腺上皮细胞分成4个组,即基础培养基、基础培养基中加入1 μg·mL-1的LPS、基础培养基中加入1 μg·mL-1的LPS和75 μg·mL-1苜蓿黄酮、基础培养基中加入75 μg·mL-1苜蓿黄酮。细胞在37 ℃, 5% CO2的培养箱中培养。结果表明:1)LPS刺激12 h后奶牛乳腺上皮细胞活性下降,而添加苜蓿黄酮能够极显著抑制LPS诱导下细胞活性的下降( P<0.01)。2)在LPS刺激下,细胞内的活性氧(ROS)浓度升高,而添加苜蓿黄酮能够显著降低其浓度( P<0.05)。3)LPS显著上调细胞的 IL-1 β IL-6、 TNF-α TLR2、 TLR4和 MyD88表达( P<0.01),而苜蓿黄酮能够显著下调细胞的 IL-1 β IL-6、 TNF-α TLR2表达( P<0.01或 P<0.05)。4)在LPS刺激下,p53、Caspase3、p38和P-p38蛋白的表达显著升高( P<0.01或 P<0.05),而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达( P<0.05)。在LPS诱导下,苜蓿黄酮能够通过降低ROS浓度,抑制细胞凋亡,提高细胞活性;可能通过抑制TLR2/MyD88信号通路来降低细胞炎症因子的表达,从而保护细胞免受炎性损伤。

关键词: 苜蓿黄酮; 脂多糖; 奶牛乳腺上皮细胞; 细胞凋亡
Effects of alfalfa flavonoids on apoptosis of bovine mammary epithelial cells induced by lipopolysaccharide
ZHAN Jin-shun1,2, CHEN Xiao-lian2, ZHAN Kang1, SU Xiao-shuang1, ZHAO Guo-qi1,*
1.College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, China
Abstract

The aim of this study was to examine the effect of alfalfa flavonoids (AF) on apoptosis of bovine mammary epithelial cells (BMECs) induced by lipopolysaccharide (LPS). The BMECs were exposed to 4 treatments; medium containing 0 μg·mL-1 LPS and AF (control), 1 μg·mL-1 LPS (L), 1 μg·mL-1 LPS and 75 μg·mL-1 AF(L+F), and 75 μg·mL-1 AF(F), respectively. The BMECs were cultured in cell incubator at 37 ℃, 5% CO2. The results were as follow: 1) AF supplementation significantly reduced the viability of BMECs stimulated by LPS for 12 h ( P<0.01). 2) LPS significantly increased the concentration of ROS in cells ( P<0.01), whereas AF supplementation significantly reduced the concentration of ROS in cells induced by LPS ( P<0.05). 3) LPS significantly increased the relative expression of IL-1 β, IL-6, TNF-α, TLR2, TLR4 and MyD88 in cells ( P<0.01), but the relative expression of IL-1 β, IL-6, TNF-α and TLR2 in cells induced by LPS was significantly reduce by AF supplementation ( P<0.01 or P<0.05). 4) LPS significantly increased the expression of p53, Caspase3, p38 and P-p38 proteins in cells ( P<0.01 or P<0.05), whereas AF supplementation inhibited the expression of p53 and p38 proteins in cells induced by LPS ( P<0.05). The results showed that AF could improve the viability of cells and inhibit apoptosis by reducing the concentration of ROS and that AF might play a role in protecting cells against inflammatory injure by inhibiting the TLR2/MyD88 signaling pathway.

Keyword: alfalfa flavonoids; lipopolysaccharide; bovine mammary epithelial cells; apoptosis

乳腺上皮细胞是合成和分泌乳汁主要场所, 当奶牛该组织在金黄葡萄球菌、大肠杆菌和链球菌等病原菌感染下, 会产生乳房炎, 进而导致产奶量和乳品质下降。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)又称内毒素, 是革兰氏阴性菌如大肠杆菌等细胞壁中的一种成分, 当细菌死亡溶解时, 其释放出来会使乳腺组织等产生损伤[1]。Shi等[2]研究发现, 奶牛乳腺上皮细胞的活性随着LPS浓度和培养时间的延长而降低; 细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性随着LPS浓度的升高呈降低趋势, 而丙二醛(MDA)含量则呈升高趋势。Sun等[3]发现, 奶牛乳腺上皮细胞在10 μ g· mL-1 LPS刺激下, 其细胞膜的渗透性增加, 促进细胞凋亡。朱丽萍等[4]发现, 奶牛乳腺上皮细胞在1 μ g· mL-1 LPS处理3~24 h后可显著增加炎症因子(TNF-α 和IL-1β )的表达。以上结果说明, LPS的刺激可促使乳腺上皮细胞的抗氧化能力下降, 增加细胞膜的通透性, 进而导致细胞凋亡。

黄酮类物质是含有2-苯基色原酮结构, 以C6-C3-C6为碳架的一类化合物, 是植物一种重要的次生代谢产物, 广泛存在于植物的根、茎、叶和花、果实中[5]。张城等[6]研究发现, 软骨细胞经LPS处理后, 细胞增殖活性降低, 细胞IL-1β iNOSP53基因mRNA的表达升高, 而添加1 μ g· mL-1金雀异黄酮能够提高增殖活性和降低这些基因的表达。姜念等[7]发现, 4', 5, 7-三羟基异黄酮能够拮抗人主动脉内皮细胞经LPS处理后引起的活力降低及ephrinB2和IL-6 mRNA的表达增加。另外, 黄芪(Astragalus membranaceus)总黄酮能够抗小鼠RAW264.7细胞经LPS诱导的炎症反应[8]。结果表明, 黄酮类物质能够提高细胞活性, 发挥抗炎症的作用。紫花苜蓿(Medicago sativa)被称为“ 牧草之王” , 是一种豆科多年生草本植物。苜蓿中黄酮含量较高, 据报道, 45个紫花苜蓿品种中有70%以上品种的总黄酮含量为0.6%~0.9%[9]。之前研究发现, 在正常培养和热应激情况下, 添加75 μ g· mL-1的苜蓿黄酮能够提高体外培养奶牛乳腺上皮细胞的活性, 改善抗氧化能力和抑制细胞凋亡[10, 11]。黄酮类化合物具有抗炎症作用, 但不同种类可能作用存在差异。因此, 本试验研究在LPS刺激下, 苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响, 为苜蓿黄酮的应用提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料

脂多糖(LPS, 血清型O55:B5)购于美国Sigma公司, 试验所用苜蓿黄酮和奶牛乳腺上皮细胞与文献[11]相同。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞活性检测 试验于2016年7月开始进行, 细胞活性采用CCK-8法进行检测。试验方法如下:试验分为4组, 即基础培养基(Con)、基础培养基中加入1 μ g· mL-1的LPS(L)、基础培养基中加入1 μ g· mL-1的LPS和75 μ g· mL-1苜蓿黄酮(L+F)、基础培养基中加入75 μ g· mL-1苜蓿黄酮(F), 每组5个重复, 其中苜蓿黄酮用二甲基亚砜[DMSO(索莱宝, 北京)]完全溶解, 4个处理组中的DMSO含量低于2‰ 。在96孔板中, 接种100 μ L· 孔-1的细胞悬液, 悬液中含有1× 104个的乳腺上皮细胞, 然后在37 ℃, 5% CO2培养箱中进行培养。待细胞完全贴壁后, 去除培养基, 磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次后加入不同处理的培养基100 μ L· 孔-1。细胞培养12和24 h后, 每孔加入10 μ L CCK-8溶液(购于上海碧云天公司), 在培养箱中孵育3 h后, 用酶标仪测定450 nm处的吸光值, 然后计算细胞活性。

细胞相对活性=(As-A0)/(Ac-A0)× 100%

式中:As为试验组的OD值; Ac为对照组的OD值; A0为空白组(只有培养基)的OD值。

1.2.2 活性氧(ROS)的检测 细胞内的ROS采用DCFH-DA检测探针(购于南京建成生物工程研究所)来检测。DCFH-DA本身没有荧光, 可以自由穿过细胞膜, 进入细胞内后, 可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜, 从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。取密度为1× 105个· mL-1细胞接种到12孔板中, 在37 ℃, 5% CO2培养箱中进行培养24 h, 去除培养基, PBS清洗两次, 试验分组同上。细胞培养12 h后, 去除细胞培养基, PBS清洗, 然后加入含有DCFH-DA(稀释1000倍)培养基1 mL孵育1 h。细胞孵育之后, 加入胰酶消化细胞(消化时间4 min), 加入培养基终止消化, 制成悬液。将细胞悬液进行1500 r· min-1离心5 min收集细胞, 然后用PBS清洗一次, 加入200~300 μ L PBS重悬细胞, 然后用流式细胞仪进行检测, 检测由扬州大学检测中心完成。

1.2.3 炎症因子基因的检测 取密度为5× 105个· mL-1细胞接种到6孔板, 在37 ℃, 5% CO2培养箱中进行培养24 h, 去除培养基, PBS清洗两次, 试验分组同上。细胞培养12 h后, 去除细胞培养基, 然后提取RNA。细胞RNA提取、cDNA合成和RT-PCR等的方法和条件同文献[12]。引物由Invitrogen公司合成, 炎症因子相关基因引物序列见表1

表1 引物设计 Table 1 Primer design

1.2.4 凋亡相关蛋白的检测 取密度为5× 105个· mL-1细胞接种到6孔板, 在37 ℃, 5% CO2培养箱中进行培养, 当每孔细胞铺满时, 将培养基去除, PBS清洗两次, 试验分组同上。细胞培养12 h后, 去除细胞培养基, 提取细胞蛋白, 然后进行Western bolt检测。一抗:p53购于英国Abcam公司, GAPDH、p38、P-p38和Caspase3购于美国Cell Signaling Technology公司; 二抗(羊抗鼠、羊抗兔)购于美国Cell Signaling Technology公司。检测方法如下:

1)根据蛋白分子量的大小配制相应的SDS分离胶(10%~12%), 将分离胶打入制胶板中, 加入无水乙醇, 室温放置40 min凝胶后, 去除乙醇, 加入浓缩胶, 插入梳子后室温放置40 min。

2)将制好的胶转入电泳槽中进行电泳, 蛋白样品上样量为30 μ g, 电泳条件为140 V, 15 min; 110 V, 65 min。

3)根据蛋白分子量的大小和参照Marker进行切胶, 铺膜, 然后在电压100 V下转膜80 min。

4)转膜结束后, 根据蛋白分子量的大小和参照Marker进行剪膜, 然后进行封闭2 h, 封闭结束后用杂交膜清洗液清洗3次。

5)加入一抗在冰上进行孵育12~16 h, 结束后用杂交膜清洗液清洗3次。

6)加入二抗在摇床上孵育2 h, 用杂交膜清洗液清洗3次后再用双色红外激光成像系统对膜进行扫描、成像, 最后利用Image J软件进行灰度值分析, 然后根据目的蛋白与GAPDH比值进行结果计算。

1.3 数据处理

基因相对表达量采用2-Δ Δ Ct方法进行计算[13], 用Excel 2007进行试验数据处理, 采用IBM SPSS Statistics 21.0单因素方差分析(ANOVA), LSD法多重比较, P< 0.05表示差异显著, P< 0.01表示差异极显著。

2 结果与分析
2.1 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞活性的影响

从图1中可知, 细胞培养12 h时, L组的细胞相对活性极显著低于其他各组(P< 0.01); 培养24 h时, F组的细胞相对活性极显著低于对照组(P< 0.01), 而显著高于其他两组(P< 0.05)。结果表明, 苜蓿黄酮能够抑制LPS刺激12 h细胞活性的下降。

图1 苜蓿黄酮对LPS刺激12和24 h下奶牛乳腺上皮细胞活性的影响Fig.1 Effect of alfalfa flavonoids on cell viability of BMECs induced by LPS for 12 and 24 h

2.2 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞ROS的影响

从图2中可知, 与对照组相比, 其他各组的ROS浓度极显著升高(P< 0.01); 而与L组相比, L+F组和F组的ROS浓度显著降低(P< 0.05)。结果表明, 苜蓿黄酮能够降低LPS刺激下细胞内ROS浓度。

图2 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞内ROS水平的影响
Con为对照组、L为脂多糖组、L+F为脂多糖加苜蓿黄酮组、F为苜蓿黄酮组。不同小写字母表示差异显著(P< 0.05), 不同大写字母表示差异极显著(P< 0.01), 相同字母表示差异不显著(P> 0.05)。下同。
Fig.2 Effect of alfalfa flavonoids on the level of ROS in BMECs induced by LPS
Con is the control group, L is the LPS group, L+F is the LPS and alfalfa flavonoids group, F is the alfalfa flavonoids group. Values with different lowercase letters mean significant difference (P< 0.05), values with different capital letters mean highly significant difference (P< 0.01) and the same letter mean no significant difference (P> 0.05).The same below.

2.3 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞炎症因子基因表达的影响

表2中可知, 与对照组相比, L组IL-1β IL-6、TNF-α TLR2、TLR4和MyD88的表达均极显著升高(P< 0.01), 而F组无显著性差异; 与L组相比, L+F组IL-1β (P< 0.01)、IL-6(P< 0.05)、TNF-α (P< 0.01)和TLR2(P< 0.01)的表达显著降低。结果表明, 苜蓿黄酮能够下调LPS刺激下细胞炎症因子的表达, 提高细胞的抗炎症作用。

表2 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞炎症因子基因表达的影响 Table 2 Effect of alfalfa flavonoids on gene expression of inflammatory factors in cells stimulated by LPS
2.4 苜蓿黄酮对脂多糖刺激下细胞凋亡蛋白表达的影响

利用软件对图3的条带进行计算, 结果见表3。与对照组相比, 在LPS刺激下, p53(P< 0.01)、Caspase3(P< 0.01)、p38(P< 0.05)和P-p38(P< 0.01)蛋白的表达显著升高, 而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达(P< 0.05)。与对照组相比, 在没有LPS刺激下, 添加苜蓿黄酮显著升高了Caspase3蛋白的表达。结果表明, LPS能够促进细胞凋亡蛋白的表达, 而苜蓿黄酮能够下调LPS刺激下细胞凋亡蛋白的表达, 抑制细胞凋亡。

图3 Western blot 结果Fig.3 The results of Western blot

表3 苜蓿黄酮对LPS刺激下细胞凋亡蛋白表达的影响 Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on expression of apoptosis protein in cells stimulated by LPS
3 讨论

脂多糖能够降低细胞的存活率, 抑制细胞增殖。刘立新等[14]研究发现, LPS能够抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。王亨等[15]发现, 添加100 mg· L-1的LPS能够显著抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖。本试验得到相似结果。之前的研究发现[10, 11], 在正常培养和热应激下, 添加苜蓿黄酮能够提高奶牛乳腺上皮细胞活性。之前有报道称, 奶牛乳腺上皮细胞活性随LPS浓度的升高呈下降趋势, 且随着培养时间的延长, 活性也呈下降趋势[2]。研究发现, 低浓度雌激素能够促进奶牛乳腺上皮细胞的增殖, 并可以提高SOD活性来发挥抗氧化作用, 而高浓度则抑制细胞增殖和降低抗氧化能力, 引起细胞损伤[16]。而紫花苜蓿黄酮以木犀草素、槲皮素、染料木黄酮等黄酮类物质为主, 而这些物质均能发挥植物雌激素的作用[17], 在本试验中, 苜蓿黄酮能够提高LPS刺激12 h奶牛乳腺上皮细胞的活性, 而对刺激24 h的效果不明显。可能是因为LPS作用时间太长对细胞损伤较大, 而且苜蓿黄酮随着培养时间的延长可能发挥类雌激素作用, 进而抑制细胞的增殖。说明苜蓿黄酮能够减缓LPS对细胞的损伤, 而且可能存在时间依赖性。LPS能够导致奶牛乳腺上皮细胞的GSH-Px、SOD和CAT活性降低, 而升高MDA含量[2]。而之前试验发现[10, 11], 苜蓿黄酮能够提高细胞抗氧化酶类的活性, 因此, 苜蓿黄酮提高细胞活性可能与其提高细胞抗氧化能力有关。

LPS是一种重要的炎症反应因子, 能够诱导TNF-ɑ 、IL-1β 、IL-6等细胞因子参与炎症反应。Chanput等[18]研究发现, 槲皮素、杨梅酮、圣草酚、柚皮素、芦丁和芹黄素均能够降低单核细胞炎症因子TNF-ɑ IL-1β IL-8和IL-10基因的表达。另外, 黄芪总黄酮、染料木黄酮和芫花总黄酮均能够抑制RAW264.7细胞TNF-ɑ 、IL-1β 和IL-6的分泌, 从而发挥抗炎[8, 19, 20]。本试验结果与其相似, 表明苜蓿黄酮亦发挥了抗炎症的作用。Toll样受体家族(TLRs)能够与不同病原体相关分子模式结合, 导致下游目的基因的活化, 进而诱导免疫应答的发生。在此过程中存在两种信号转导通路, 即依赖MyD88和非依赖MyD88。除TLR3为非依赖MyD88, 其他均为依赖MyD88[21]。Li等[22]研究发现, 芒果苷能够抑制LPS诱导口腔上皮细胞TLR2和TLR4的过表达, 抑制NF-κ Bp38和JNK的表达。Feng等[23]发现, 大豆黄酮能够抑制LPS诱导小鼠肺组织的TLR4、MyD88的过表达和NF-κ B活性。Sun等[24]研究发现, 黄芩苷可能通过抑制TLR2和TLR4/MyD88/p38/NF-κ B信号来达到抗炎作用。另外, 山姜素可能通过抑制TLR4调节NF-κ B信号通路来发挥抗炎作用, 从而抑制LPS诱导小鼠发生乳房炎[25]。从本试验的结果来看, 苜蓿黄酮降低了TLR2和MyD88基因表达和p38蛋白表达。结果说明, 苜蓿黄酮可能通过抑制TLR2/MyD88/p38信号, 降低炎症因子的表达, 从而达到抗炎症的作用。

张宸豪等[26]研究发现, 随着LPS浓度增加, RAW264.7细胞内ROS的水平也增加。本试验也发现, 在LPS刺激下, 细胞内的ROS浓度升高。邓伟等[27]研究发现, 橙皮素能够抑制LPS诱导H9C2心肌细胞ROS产生, 说明黄酮类物质具有降低细胞ROS浓度的功能。从本试验结果来看, 在LPS刺激下, 苜蓿黄酮发挥抑制细胞内ROS产生的作用, 这可能与其提高细胞抗氧化酶类活性有关。细胞内的ROS能够与细胞膜的双磷脂分子层及膜蛋白相结合, 增加细胞膜通透性, 导致DNA受损, 进而促使细胞凋亡和死亡。Caspases家族中的大多数成员是开启细胞凋亡的效应子, 其中Caspase 3被认为是凋亡的关键蛋白酶, 其一旦被激活, 细胞凋亡就不可避免。从本试验结果看, 在LPS刺激下, 苜蓿黄酮虽降低细胞Caspase-3蛋白的表达, 但未达到显著性差异, 说明苜蓿黄酮对Caspase-3蛋白的表达影响不大。然而, 在正常培养下, 苜蓿黄酮显著提高了细胞Caspase-3蛋白的表达, 原因可能是苜蓿黄酮发挥了类雌激素作用, 导致细胞氧化, 提高ROS浓度所致。p53是一种抑癌基因, 其主要功能是通过促进DNA修复蛋白的转录合成来完成DNA损伤的修复。当该修复无法完成时, p53会促使凋亡相关蛋白如Fas、Apaf-1、Bax等的表达, 进而导致细胞凋亡。另外, p53能够与Bcl-xL、Bcl-2的结合或者直接结合并激活Bak, 诱导Bak寡聚, 进而导致细胞色素C释放和促进细胞凋亡。细胞内的ROS浓度增加, 会促使p53基因表达升高, 进而促进细胞凋亡[28]。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是丝氨酸/苏氨酸激酶高度相关的蛋白激酶超家族, 其是细胞内一种重要的信号传导系统, 能够被LPS所激活。p38MAPK能够通过提高c-myc表达、磷酸化p53、参与Fas/Fasl介导的凋亡、诱导Bax转位和增强TNF-α 表达等来促进细胞凋亡[29]。从本试验发现, 在LPS刺激下, p53和p38蛋白的表达升高, 而添加苜蓿黄酮能够抑制它们的表达。说明在LPS刺激下, 苜蓿黄酮可能通过降低细胞内的ROS浓度, 抑制p53和p38蛋白的表达, 进而抑制细胞的凋亡。

在LPS刺激下, 苜蓿黄酮能够降低奶牛乳腺上皮细胞内ROS的浓度, 抑制p53和p38等凋亡蛋白的表达, 从而抑制细胞凋亡, 提高细胞活性。另外, 苜蓿黄酮可能通过抑制TLR2/MyD88/p38信号, 进而降低TNF-ɑ 、IL-1β 和IL-6等炎症因子基因的表达, 从而发挥抗炎症的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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