试验于2015年4-7月在甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室日光温室进行。供试燕麦品种 ‘ 定莜6号’ 种子用1%次氯酸钠表面消毒后在瓷盘中25 ℃催芽, 选露白一致的萌发苗播种在装满珍珠岩的塑料盆(口径20 cm, 高14 cm)中, 浇水后置日光温室培养, 昼/夜温度(23± 6) ℃/(17± 7) ℃, 相对湿度60%~80%, 光照强度360~710 μ mol· m^-2· s^-1。幼苗两叶一心期选留长势一致的壮苗约200株/盆, 三叶一心期用Hoagland营养液浇灌一次, 然后进行处理。

试验设6个处理:1) CK(对照):喷蒸馏水+根施蒸馏水; 2) T₁:喷蒸馏水+根施75 mmol· L^-1 NaHCO₃; 3) T₂:喷0.01 mmol· L^-1 H₂O₂+根施75 mmol· L^-1 NaHCO₃; 4) T₃:喷0.01 mmol· L^-1 H₂O₂+根施蒸馏水; 5) T₄:喷 0.01 mmol· L^-1 H₂O₂+根施75 mmol· L^-1 NaHCO₃+根施5 mmol· L^-1二甲基硫脲(DMTU); 6) T₅:喷0.01 mmol· L^-1 H₂O₂+根施75 mmol· L^-1 NaHCO₃+根施2 mmol· L^-1 抗坏血酸(ASA)。

DMTU是H₂O₂的淬灭剂, ASA是H₂O₂的清除剂, DMTU、ASA和NaHCO₃实验浓度参考文献[5, 7, 9]并由预试验筛选确定。为避免碱冲击幼苗, NaHCO₃浓度每天按25 mmol· L^-1递增至终浓度75 mmol· L^-1后记为开始试验处理。叶面喷施于每天8:00和19:00进行, 喷施量以叶面滴液为限, 每盆喷施量约10 mL, 为降低表面张力, 喷施液中加2滴吐温-80。根部浇灌每天19:00进行, 浇灌量800 mL。处理7 d后取幼苗叶片用液氮速冻后-70 ℃保存, 用于测定相关生理指标。每5盆为1个重复, 重复3次, 随机排列。

幼苗鲜重测定采用称重法^[5]; 超氧阴离子( O2·-)含量测定按高俊凤^[12]的方法; H₂O₂含量参照Sergiev等^[13]的方法测定; 丙二醛(MDA)含量测定按李合生^[14]的方法; 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及抗坏血酸(ASA)和谷胱甘肽(GSH)含量测定按陈建勋等^[15]的方法; 可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸和脯氨酸含量测定按李合生^[14]的方法; 有机酸和叶绿素含量测定按高俊凤^[12]的方法。所有测定指标以单位鲜重材料计算结果, 用平均值± 标准差表示。

采用Excel 2003处理数据和绘图, SPSS 20.0方差分析和Duncan法多重比较(P< 0.05)。将所检测的16项指标测定值离差标准化后进行SPSS 20.0主成分分析, 结果提取4个主成分, 方差贡献率分别为57.155%、21.529%、8.393%和7.182%, 累积贡献率达94.260%, 计算得出4个主成分的得分值后按王玲等^[16]的方法计算隶属函数值

U(X_j), 以方差贡献率占累积贡献率的比重作为权重W_j, 分别为0.606、0.228、0.089和0.076, 按公式D=∑ [U(X_j)× W_j]计算出各处理的综合评价值(D)。

燕麦幼苗三叶一心期进行75 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫, 取幼苗倒2叶检测H₂O₂含量显示, 当胁迫9 h时H₂O₂出现爆发式骤增, 随即急剧降低后转向逐渐升高(图1A)。H₂O₂“ 猝发” 说明其可能作为一种信号参与碱胁迫响应, 随胁迫时间延长H₂O₂又快速积累可能是碱胁迫伤害的表现。燕麦幼苗在75 mmol· L^-1 NaHCO₃胁迫的同时喷施0.001~5 mmol· L^-1 H₂O₂ 7 d后发现, 0.001~1 mmol· L^-1 H₂O₂能够提高燕麦幼苗鲜重, 其中0.01 mmol· L^-1 H₂O₂效果最佳(图1B)。因此, 以0.01 mmol· L^-1 H₂O₂作为燕麦响应碱胁迫的实验浓度。

图1

Fig.1

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图1 75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下燕麦幼苗叶片内源H2O2含量变化(A)及喷施不同浓度H2O2对幼苗鲜重的影响(B) CK:Control; T0:75 mmol· L-1 NaHCO3; T1:75 mmol· L-1 NaHCO3+0.001 mmol· L-1 H2O2; T2:75 mmol· L-1 NaHCO3+0.01 mmol· L-1 H2O2; T3:75 mmol· L-1 NaHCO3+0.1 mmol· L-1 H2O2; T4:75 mmol· L-1 NaHCO3+1 mmol· L-1 H2O2; T5:75 mmol· L-1 NaHCO3+5 mmol· L-1 H2O2.不同字母表示处理间差异显著(P< 0.05), 下同。Fig.1 Change of endogenous H2O2 contents in leaves (A) and effects of spraying 0.001-5 mmol· L-1 H2O2 for 7 days on fresh eight of oat seedlings under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress (B) Different letters indicate significant difference among the treatments (P< 0.05). The same below.

从表1可知, NaHCO₃胁迫(处理T₁)引起了燕麦叶片 O2·-、H₂O₂和MDA含量的显著升高和叶绿素含量的下降, 而喷施H₂O₂(处理T₂)有效抑制了NaHCO₃胁迫下 O2·-、H₂O₂和MDA含量升高及叶绿素含量下降的幅度; 添加DMTU或ASA后部分逆转了H₂O₂对NaHCO₃胁迫下 O2·-的抑制, 却显著提高了H₂O₂含量, 降低了叶绿素含量, MDA含量在添加DMTU后(处理T₄)显著升高, 添加ASA后(处理T₅)却没有明显变化; 单独喷施H₂O₂(处理T₃)与CK相比提高了H₂O₂含量, 却降低了 O2·-含量, MDA含量变化不大。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 喷施0.01 mmol· L-1 H2O2对75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下燕麦幼苗叶片 O2·-、H2O2、MDA和叶绿素含量的影响 Table 1 Effect of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on O2·-, H2O2, MDA and chlorophyll ontents in oat seedling leaves under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress 处理 Treatment O2·-含量 O2·- content (nmol· g-1) H2O2含量 H2O2 content (μ mol· g-1) MDA含量 MDA content (nmol· g-1) 叶绿素含量 Chlorophyll content (mg· g-1) CK 11.29± 0.310bc 6.30± 0.122e 13.03± 0.808c 5.28± 0.140a T1 17.49± 1.271a 11.88± 0.926c 23.80± 1.442a 3.26± 0.120c T2 9.57± 0.393cd 9.97± 0.765d 16.27± 0.971b 4.26± 0.177b T3 8.47± 0.208d 9.77± 0.032d 13.77± 1.380c 5.29± 0.176a T4 12.42± 1.231b 15.80± 0.440a 24.30± 1.800a 2.57± 0.111d T5 11.44± 1.510b 13.62± 0.325b 17.63± 1.102b 2.47± 0.097d CK:Control, 喷水spraying H2O+根部浇水root application H2O; T1:喷水spraying H2O+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3; T2:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3; T3:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根部浇水root application H2O; T4:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3+根施root application 5 mmol· L-1 DMTU; T5:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3+根施root application 2 mmol· L-1 ASA. 同列不同字母表示P< 0.05水平差异显著, 下同。Different letters within the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

表1 喷施0.01 mmol· L-1 H2O2对75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下燕麦幼苗叶片 O2·-、H2O2、MDA和叶绿素含量的影响 Table 1 Effect of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on O2·-, H2O2, MDA and chlorophyll ontents in oat seedling leaves under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress

图2表明, 与CK相比, NaHCO₃胁迫(处理T₁)下燕麦幼苗叶片SOD、APX活性和ASA、GSH含量显著降低, CAT和POD活性明显升高; 喷施H₂O₂(处理T₂)提高了NaHCO₃胁迫下SOD、APX活性和ASA、GSH含量, 降低了CAT、POD活性; 添加DMTU处理(T₄)与处理T₂相比SOD、CAT、POD、APX活性和ASA、GSH含量均显著降低; 施用ASA处理(T₅)与处理T₂相比SOD、CAT、POD、APX活性和GSH含量显著降低, 而ASA含量却明显升高; 单独喷施H₂O₂(T₃)与CK相比, SOD、APX活性和GSH含量降低, CAT、POD活性提高, ASA含量变化不大。

图2

Fig.2

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图2 75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下外源H2O2对燕麦幼苗叶片抗氧化系统的影响Fig.2 Effect of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on antioxidant system in leaves of at seedlings under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress CK:Control, 喷水spraying H2O+根部浇水root application H2O; T1:喷水spraying H2O+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3; T2:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3; T3:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根部浇水root application H2O; T4:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3+根施root application 5 mmol· L-1 DMTU; T5:喷spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2+根施root application 75 mmol· L-1 NaHCO3+根施root application 2 mmol· L-1 ASA. 下同The same below.14

由表2可知, 与CK相比, 碱胁迫(处理T₁)提高了燕麦幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸和脯氨酸含量, 有机酸含量明显下降; 喷施H₂O₂(处理T₂)降低了碱胁迫下可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量, 提高了有机酸含量, 可溶性蛋白质含量无显著变化; 施用H₂O₂淬灭剂DMTU处理(T₄)与处理T₂相比可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸、脯氨酸含量均显著提高, 但有机酸含量明显下降; 施用H₂O₂清除剂ASA处理(T₅)与处理T₂相比可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸、脯氨酸含量也是显著提高, 而有机酸含量明显下降; 单独喷施H₂O₂处理(T₃)与CK相比, 可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸含量都显著提高, 脯氨酸含量明显下降, 而有机酸含量变化不大。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下喷施0.01 mmol· L-1 H2O2对燕麦幼苗叶片渗透调节物质含量的影响 Table 2 Effect of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on osmotica content in oat eedling leaves under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress 处理 Treatment 可溶性糖 Soluble sugar (mg· g-1) 可溶性蛋白质 Soluble protein (mg· g-1) 游离氨基酸 Free amino acid (mg· g-1) 脯氨酸 Proline (μ g· g-1) 有机酸 Organic acid (μ g· g-1) CK 0.251± 0.001d 0.244± 0.012d 0.420± 0.012f 18.5± 0.321e 5.08± 0.079a T1 0.456± 0.004a 0.328± 0.011c 0.691± 0.002c 22.6± 0.400c 2.50± 0.185c T2 0.357± 0.004b 0.328± 0.005c 0.546± 0.001d 20.0± 0.361d 3.94± 0.109b T3 0.264± 0.008c 0.334± 0.005c 0.445± 0.002e 17.2± 0.115f 2.46± 0.312cd T4 0.467± 0.007a 0.391± 0.004b 0.879± 0.002b 29.7± 1.436a 2.15± 0.121de T5 0.469± 0.011a 0.446± 0.003a 0.994± 0.003a 25.7± 0.115b 2.07± 0.148e

表2 75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下喷施0.01 mmol· L-1 H2O2对燕麦幼苗叶片渗透调节物质含量的影响 Table 2 Effect of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on osmotica content in oat eedling leaves under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress

由图3A可知, 与CK相比, NaHCO₃胁迫(处理T₁)显著降低了燕麦植株鲜重, 降幅达36.4%。喷施H₂O₂(处理T₂)显著缓解了NaHCO₃胁迫燕麦幼苗鲜重的降幅, 增添DMTU(处理T₄)和ASA(处理T₅)完全逆转了H₂O₂对NaHCO₃胁迫下燕麦幼苗鲜重下降的缓解作用; 单独喷施H₂O₂(处理T₃)与CK相比显著提高了燕麦幼苗鲜重, 增幅为15.5%。

对检测的 O2·-、H₂O₂、MDA、SOD、CAT、POD、APX、ASA、GSH、可溶性糖、可溶性蛋白质、游离氨基酸、脯氨酸、有机酸、叶绿素和鲜重16项指标进行主成分和隶属函数分析, 得出各处理燕麦幼苗的综合评价值(D)。如图3B显示, 与CK相比, NaHCO₃胁迫(处理T₁)显著降低了燕麦幼苗的D值, 喷施 H₂O₂(处理T₂)提高了NaHCO₃胁迫(处理T₁)燕麦幼苗的D值; 添加DMTU(处理T₄)和ASA(处理T₅)完全或部分逆转了H₂O₂的作用; 单独喷施H₂O₂处理(T₃)的D值显著低于CK。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 75 mmol· L-1 NaHCO3胁迫下喷施0.01 mmol· L-1 H2O2对燕麦幼苗鲜重的影响及其耐碱性综合评价Fig.3 Effects of spraying 0.01 mmol· L-1 H2O2 on fresh weight of oat seedlings under 75 mmol· L-1 NaHCO3 stress and comprehensive evaluation to alkali resistance of oat seedlings

Fedina等^[17]研究发现, 外源H₂O₂预处理能显著降低盐胁迫下大麦(Hordeum vulgare)幼苗MDA和内源H₂O₂含量。Abdul等^[8]指出, 用H₂O₂浸种能够通过缓解氧化伤害提高小麦幼苗的耐盐性^[8]。本试验表明, 碱胁迫下燕麦幼苗发生H₂O₂“ 猝发” 现象(图1A), 喷施H₂O₂能够有效抑制碱胁迫燕麦叶片 O2·-、H₂O₂和MDA的积累(表1), 提高植株生物量(图1B); 而H₂O₂淬灭剂DMTU和清除剂ASA能够部分逆转H₂O₂抑制碱胁迫下 O2·-的产生, 并提高H₂O₂和MDA水平(表1)。表明H₂O₂可能作为一种胁迫信号能够减轻碱胁迫诱导的活性氧积累对燕麦细胞膜脂的过氧化损伤。这与H₂O₂能够缓解盐胁迫小麦^[8]和受旱黄瓜^[9]氧化伤害的结果一致。H₂O₂能够减轻活性氧积累对细胞膜脂氧化伤害的原因可能与它参与植物抗氧化系统的调节密切相关。Uchida等^[6]研究表明, H₂O₂不仅能够诱导盐胁迫下水稻活性氧清除酶的活性, 而且能够增强胁迫相关酶基因的表达。Gao等^[18]发现, 外源H₂O₂通过提高SOD、CAT、APX等抗氧化酶活性, 降低热胁迫下黄瓜叶片的活性氧和MDA含量。本试验表明, 喷施H₂O₂提高了碱胁迫下燕麦叶片的SOD、APX活性和ASA、GSH含量, 却降低了CAT、POD活性, 而H₂O₂淬灭剂和清除剂能够逆转H₂O₂对碱胁迫燕麦抗氧化系统的这种调节作用(图2), 说明H₂O₂参与碱胁迫燕麦抗氧化系统的调节。这与外施H₂O₂可提高低温胁迫下葡萄SOD活性^[10]及镉胁迫下水稻GSH含量^[11], 降低MDA含量的结果一致^{[10, 11]}, 而与外源H₂O₂可提高干旱胁迫下黄瓜SOD、CAT、POD、APX等活性的结果有所区别^[9]。这可能与植物种类及胁迫类型等有关。外源H₂O₂提高植物抗氧酶活性的原因可能与它能够上调其编码基因表达有关^{[6, 10]}, 而对抗氧化物质含量调节的机理有待进一步探究。

积累渗透溶质是燕麦适应碱胁迫的重要特征^[5]。可溶性糖和脯氨酸等是细胞主要的有机渗透溶质。本研究表明, 喷施H₂O₂降低了碱胁迫下燕麦叶片的可溶性糖、游离氨基酸和脯氨酸含量, 却提高了有机酸含量; H₂O₂淬灭剂或清除剂逆转了H₂O₂的这种调节作用(表2)。表明H₂O₂参与燕麦幼苗耐碱性适应过程渗透溶质积累的调控。这与外源H₂O₂预处理可降低NaCl胁迫下大麦叶片脯氨酸含量的结果一致^[18], 但与张波等^[19]的外源H₂O₂提高盐胁迫下小麦可溶性糖含量的结果不同。说明不同胁迫下植物种类不同积累渗透溶质的机制存在差异。喷施H₂O₂降低碱胁迫下燕麦可溶性糖含量可能是其作为信号参与调节气孔关闭^[7]后影响光合作用所致, 游离氨基酸和脯氨酸含量下降可能与喷施H₂O₂后降低碱胁迫燕麦内源H₂O₂含量(表1)使蛋白质降解下降有关^[20], 但H₂O₂促进碱胁迫下有机酸积累的机制有待进一步探讨。

生物量是燕麦耐碱性强弱的直接指标, 也是生理响应的综合体现^[5]。植物生物量与参与光合作用光能吸收和传递的叶绿素含量密切相关^[1]。本试验表明, 喷施H₂O₂有效抑制了碱胁迫下燕麦幼苗叶绿素含量(表1)和植株鲜重(图3A)的降幅, H₂O₂淬灭剂或清除剂完全逆转了H₂O₂的作用。这与Azevedo等^[21]的外源H₂O₂能够缓解盐胁迫玉米(Zea mays)幼苗生长抑制的结论一致。说明外源H₂O₂能够增强燕麦幼苗的耐碱性。这可能一方面归因于H₂O₂对燕麦幼苗SOD、APX活性和ASA、GSH含量的提升作用(图2), 使碱胁迫产生的活性氧能够快速地被清除, 从而阻止了对细胞膜脂的过氧化伤害(表1); 另一方面, 可能与H₂O₂参与碱胁迫下燕麦幼苗渗透溶质积累的调节有关(表2), 尤其是对有机酸积累的促进作用可能对增强燕麦适应碱胁迫造成的高pH胁迫发挥了重要作用。为了综合评价喷施H₂O₂对燕麦幼苗耐碱性的影响, 采用主成分分析提取了4个独立的综合性指标替代所检测的16项指标, 方差累积贡献率达94.26%, 对4个主成分得分值采用隶属函数分析综合评价耐碱性结果显示, 喷施 H₂O₂显著提高了碱胁迫下燕麦幼苗的综合评价值, H₂O₂的作用可被H₂O₂淬灭剂或清除剂部分或完全逆转(图3B), 这与H₂O₂对生物量的影响基本一致(图3A), 充分证明外源H₂O₂能够提高燕麦幼苗对碱胁迫的适应能力。